ACA(+)復發性流產蛻膜基因芯片檢測

周 旋*，馮曉玲，周偉達

（1.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036； 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.黑龍江省第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

復發性流產屬婦產科疑難雜病，免疫因素在復發性流產中的比例占60.18%[1]主要原因是抗磷脂綜合征，而抗心磷脂抗體(ACA)陽性又是引起復發性流產的主要免疫因素。RSA受多條基因控制，本研究應用Agilent Human Gene Expression （4*44K，Design ID：014850）芯片篩選出ACA(+) RSA及正常妊娠人流蛻膜中的差異表達基因，總結并且分析這些差異基因的生物學途徑、分子功能、和細胞組件，從基因水平揭示ACA(+) RSA的發病機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 ACA(+)RSA組（試驗組）

20例；年齡23～36歲，平均（28.7±4.5）歲。

病例來自本院患者，符合WHO的《復發性流產的病名及診斷標準》，且ACA陽性，現妊娠5～8周胚胎停育者。

1.1.2 正常妊娠組（對照組）

20例；年齡21～36歲，平均（27.4±5.7）歲。病例來自本院門診，有過至少一次成功分娩史，現妊娠5～8周，胚胎正常，要求行人流術者。

分別收取兩組患者蛻膜2 g，用凍存管保存至-80℃。

1.2 基因芯片的制備和雜交

首先使用Agilent Bioanalyzer 2100檢測樣品總RNA質量，合格后通過NanoDrop ND-2000進行定量，然后得到cRNA，最后雜交基因芯片，通過掃描Agilent Scanner G2505C，最終獲得原始的圖像。整個過程由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.3 差異基因數據分析

原始數據的處理使用Feature Extraction 軟件(version10.7.1.1)，quantile標準化以及后續分析使用Genespring軟件(version 12.5)，差異基因篩選根據T檢驗的p值和倍數變化值Fold change，標準為Fold change值≥2.0且P值≤0.05。對差異基因進行GO和KEGG富集分析以及非監督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

2 結 果

2.1 差異篩選統計

通過計算兩組芯片探針的P值和倍數變化值，共篩選出差異表達基因851條，包括234條上調表達基因和617條下調表達基因，其中部分差異表達顯著的基因的功能主要與信號轉導、細胞粘附、細胞增殖、細胞凋亡、受體結合活性、細胞因子活性及生長因子活性等有關，如 IL-20、PI3K、CD80、TNFRSF1B等基因的表達顯著上調，IL19、CXCL5、CXCL3、MMP26等基因的表達則顯著下調。

2.2 基因和通路分析

KEGG結果顯示見圖1，根據差異基因的比例和KEGG數據庫相結合得出，ACA(+)RSA早期難免流產與正常早期妊娠婦女相比，主要是以下幾個方面出現了差異：細胞因子及其受體之間的相互作用、谷氨酸突觸、破骨細胞的分化、蛋白質的消化和吸收、礦物質的吸收、視黃醇的代謝、細胞色素p450的異物代謝、細胞色素p450的藥物代謝、細胞外基質受體的相互作用、小細胞肺癌以及膽汁分泌。

接著，根據差異基因在各信號通路上的數量和差異倍數，總結出ACA(+)RSA早期難免流產相關的信號通路一共有5條，分別是TLR4/NF-κB信號通路、依賴性蛋白激酶信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路。

基因芯片研究發現與TLR4/NF-κB信號通路相關的差異基因有4個,與對照組比較ACA(+)RSA早期難免流產組上調的基因有3個，包括TLR4、NF-κB、TNF-ɑ,下調的基因有1個，包括COx2。見圖1。

圖1 基因芯片KEGG分析

3 討 論

目前，復發性流產的發病率在臨床可見逐年上升，不僅嚴重危害女性的身心健康，而且大大的影響夫妻感情導致家庭關系不睦[2-3]，所以探究復發性流產的發病機制迫在眉睫，本文從基因水平研究復發性流產的發病機制，篩選出ACA(+)RSA相關的信號通路及差異基因。目前認為ACA導致RSA機制為：ACA 可以和磷脂結合蛋白相結合，降低抗凝的活性[4]，影響血管內皮細胞[5]，干擾抗凝系統[6]，最終促使免疫平衡紊亂，促使血管內血栓形成。隨著胎盤血管血栓形成的加重，導致子宮內膜血流異常[7]，進而引起胎盤血流異常，導致胎盤梗死、形成缺陷以及慢性炎癥等，最終損傷胎盤功能，導致流產。

本研究通過基因芯片檢測發現TLR4及其信號傳導途徑在抗體介導的ACA血栓形成機制中扮演著重要的角色。在免疫領域中妊娠免疫較為特殊，有研究提出在妊娠時，TLR4在非特異性免疫中發揮著重要作用，此時炎性細胞因子增強非特異性免疫[8]。實驗表明存在于抗磷脂抗體綜合征血清的高表達的抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody,aPL）和他的病理機制關系很大，而aPL的重要靶抗原則是β2糖蛋白I（beta-2-glycoprotein I,β2GPI)。有研究表明β2GPI抗體廣泛存在于反復患血栓性疾病的患者，而來自于親和純化的抗磷脂抗體綜合征患者的抗β2GPI抗體可以促進小鼠的血栓產生[9]。有研究[10]表明，LPS能使內皮細胞被激活，它和β2GPI擁有同樣的信號通路，當內皮細胞綁定了β2GPI抗體抗原復合物后，能夠激活TLR4，進而激活TLR4/NF-κB信號通路。

本實驗通過基因芯片技術篩查出TLR4是抗心磷脂抗體陽性復發性流產早期難免流產和正常早期妊娠間的差異基因，推測其可能是參與誘抗心磷脂抗體陽性復發性流產早期難免流產的重要基因。