輪作不同葉菜對連作豇豆土壤養分及微生物特性的影響

倪 苗 成善漢 韓 旭 王龍飛 雷 欣 居利香 汪志偉 朱國鵬

（海南大學熱帶農林學院，海南海口 570228）

豇豆（Vigna unguiculateL.）在海南省冬季設施栽培的瓜菜面積中排名第二，是海南省農民重要的收入來源（劉子記 等，2016）。由于豇豆連年種植，重茬地塊增多，土壤板結，肥力下降，微生物多樣性降低，多種病蟲害同時發生，危害嚴重，致使農戶隨意加大藥量和施用頻次，不僅增加了農民的種植成本，且嚴重威脅農產品的質量安全（吉清妹 等，2011）。土壤養分與微生物組成是衡量土壤肥力的重要指標，土壤中病原菌很難在微生物多樣性高的土壤中生長、繁殖（Shiomi et al.，1999）。同一種作物的連茬種植，容易破壞土壤的微環境，降低微生物的多樣性，土壤的利用能力下降，形成連作障礙（孟令波 等，2017）。研究表明，合理輪作有助于連作障礙的緩解（Larkin & Halloran，2014；喻景權和周杰，2016），如番茄和萵苣、草莓和生菜、草莓和茼蒿等輪作有助于連作障礙的緩解，改善土壤微生物條件，提高作物的經濟效益（蔡偉建 等，2017）。

豇豆和葉菜輪作是海南蔬菜種植的常用模式，輪作葉菜有利于土壤肥力的保持以及土壤微生物結構的改善。本試驗以出現明顯連作障礙的設施大棚土壤為材料，以菜薹（菜心）（Brassica campestrisL.）、莧菜（Amaranthus tricolor）、蕹菜（空心菜）（Ipomoea aquaticaForsk）、芥菜（Brassica junceaL.）、大白菜（Brassica rapa pekinensis）為輪作作物，研究輪作前后土壤養分及微生物的變化，以期得到適宜的豇豆—葉菜輪作模式，為海南地區大棚蔬菜設施栽培的高產高效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蔬菜品種：夏冠2號油白豆角，購自汕頭市澄海區成啟種子貿易商行；春梅菜心、嚴選紅圓葉莧菜、泰國空心菜、夏美白菜F1均購自汕頭市金韓種業有限公司；特選大坪埔大肉包心芥菜購自江門利隆種業有限公司。

1.2 試驗設計

試驗于2017年在三亞市妙林洋設施大棚基地進行，土壤為連續6 a種植豇豆的連作地，連作障礙嚴重，土壤基礎肥力：pH為6.40，有機質17.55 g·kg-1，全氮 0.891 g·kg-1，堿解氮 148.56 mg·kg-1，速效磷 180.24 mg·kg-1，速效鉀 62.25 mg·kg-1。試驗共設置6個處理，分別為輪作菜心、莧菜、空心菜、芥菜和大白菜，以連作豇豆為對照。每個處理3次重復，每處理小區長25 m，寬1.5 m，面積為37.5 m2。田間施肥與輪作管理方式如下：4月9日播種前以復合肥（N-P2O5-K2O為5-15-15，275 kg·hm-2）作基肥，4月28日在豇豆的結莢初期及葉菜的生長盛期追肥1次；5月13日葉菜采收后，清除植株殘體，整地后于5月17日播種第2茬葉菜，并于6月3日豇豆的盛收期進行第2次追肥，追肥的肥料種類、用量與基肥一致，豇豆與葉菜在6月23日全部采收結束。

1.3 土樣采集

蔬菜全部收獲后按5點取樣法選取菜根附近的土壤采樣點，用直徑5 cm的土鉆采集0～20 cm處表土。并將混勻后的土壤樣品分成2份，一份放置于陰涼通風處自然風干，并過篩用于土壤養分的測定，一份鮮樣于-80 ℃保存，用于土壤微生物檢測與分析。

1.4 土壤養分測定

土壤基本養分的測定采用常量分析法（鮑士旦，2000），其中pH測定采用pH計法（電位）；全氮含量測定采用半微量凱氏法；堿解氮含量測定采用堿解擴散法；土壤有機質含量測定采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法；有效磷含量測定采用氟化銨-鹽酸提取-鉬銻抗比色法；速效鉀含量測定采用1 mol·L-1乙酸銨浸提-火焰光度法。

1.5 土壤微生物多樣性分析

1.5.1 土壤樣本DNA提取及PCR擴增 分別稱取各處理土壤樣本，用土壤基因組DNA提取試劑盒HiPure Soil DNA Kits（Magen公司）按說明書步驟提取土壤中的DNA。按指定測序區域設計特異引物，對細菌16S rDNA V4+V5區域進行PCR擴增，引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）與907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）（許穎等，2016）；真菌引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 與ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）（Yang et al.，2016）。PCR擴增利用GeneAmp PCR System 9700型PCR儀，采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公 司 ），20μL反應體系：10 μL 5× PrimeSTAR Buffer（含Mg2+）；4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP Mixture；正反向引物各 1 μL（5 μmol·L-1）；0.4 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase；10.0 ng模板DNA，補足ddH2O至20 μL。PCR反應程序：98 ℃ 1 min；98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，27個循環；72 ℃延伸5 min。使用Axy-Prep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）對PCR產物進行切膠回收，Tris-HCl洗脫。

1.5.2 測序 用illumina MiSeq測序儀與illumina建庫試劑盒對得到的片段建庫測序，測序策略為PE250。

1.6 數據處理

1.6.1 試驗數據 利用SPSS 19.0和Excel 2013軟件進行分析統計作圖。

1.6.2 土壤微生物多樣性分析 采用高通量測序技術，檢測細菌基因V4+V5區域、真菌基因ITS區域。對PCR產物進行測序，拼接成tag，并根據tag進行物種分類、OTU分析、多樣性分析等。用Mothur（v.1.34.0）軟件將細菌16S rDNA測序及真菌ITS測序所得tags進行OTU（operaing taxonomic unit）聚類，得各樣本0.03距離（97%相似度）OTU數量。Alpha多樣性采用Mothur（v.1.34.0）軟件、基于OTU結果對單個樣本內的物種多樣性進行分析，包括Chao1值、Ace值以及Shannon指數等（Kemp & Aller，2004）。Chao1值、Ace值是根據細菌16S rDNA測序或真菌ITS測序所得tags數和OTU的數量以及相對比例來預測樣本中細菌或真菌的種類，是基于已知結果所得的相對值（高琳 等，2016）。Shannon指數：抽樣n個tags計算Shannon指數的期望值。

最佳分類水平的確定：首先統計出各分類水平上的tag序列數，用以確定樣本微生物的最佳物種分類水平。

最佳分類水平上的物種分布堆疊圖：分析軟件為R語言Ggplot2包。基于以上確定的最佳分類水平進行繪制，以堆疊圖的形式直觀展示不同樣本在最佳分類水平上的物種豐度的變化情況。為了使展示畫面美觀，本試驗中只展示至少在一個樣本中的表達豐度達到2%的物種。

2 結果與分析

2.1 不同輪作處理對土壤養分的影響

由表1可知，不同輪作處理的土壤pH發生了改變，輪作莧菜、芥菜和大白菜處理顯著高于對照，但各處理土壤還是處于酸性土壤的狀態。輪作莧菜處理的土壤有機質含量顯著高于其他處理，比對照提高20.92%，輪作大白菜處理的含量最低，比對照降低8.83%，輪作莧菜、空心菜、菜心可以提高土壤有機質含量。各處理的土壤全氮含量均與對照無顯著差異。各輪作處理的土壤堿解氮含量都顯著高于對照，其中輪作莧菜與芥菜處理較高。輪作莧菜處理的土壤速效磷含量顯著高于對照和其他處理，比對照增加了28.74%。各處理的土壤速效鉀含量差異不顯著。

2.2 不同輪作處理對土壤微生物豐度與多樣性的影響

Ace值是用來估計群落中含有OTU數目的指數，使用Chao1算法估算群落中所含OTU數目，其中，Ace、Chao1和OTU的數值越大代表樣本中所含物種越多；Shannon指數用于評估樣本中物種組成的多樣性，數值越大表示該環境的物種越豐富，多樣性越高（Pennisi，2004；Pitta et al.，2014；Sun et al.，2015）。通過高通量測序結果可知（表2），各處理細菌的OTU數與對照相比都有所上升，其中輪作莧菜與芥菜處理較高，顯著高于對照；各處理細菌群落的Ace值與Shannon指數與對照差異不顯著，輪作莧菜與菜心處理的Chao1指數顯著高于對照；上述結果表明各處理對土壤的細菌多樣性影響不大，但輪作處理提高了土壤細菌群落的豐度。真菌群落多樣性指數在不同處理下存在明顯差異，各處理的真菌OTU數均高于對照，其中輪作莧菜與芥菜處理與對照差異顯著；Ace值與Chao1指數各處理之間無顯著差異，而輪作莧菜處理的Shannon指數顯著高于對照，輪作芥菜和大白菜處理次之；表明輪作處理對土壤真菌群落的豐度影響不大，但能提高土壤真菌的多樣性。

表1 不同輪作處理對土壤養分的影響

表2 不同輪作處理對土壤微生物豐度與多樣性的影響

2.3 不同輪作處理對土壤微生物群落結構的影響

2.3.1 土壤細菌群落結構變化 由圖1可知，處理土壤共有20個優勢細菌目（相對豐度＞1%，其余為others），包括Acidobacteriales（酸桿菌目 ）、Actinomycetales（放線菌目）、Bacillales（芽孢桿菌目）、Burkholderiales（伯克氏菌目）、Cytophagales（噬纖維菌目）、Lactobacillales（乳桿菌目）、Myxococcales（黏球菌目）、Nitrospirales（硝化螺旋菌目）、Rhizobiales（根瘤菌目）、Rhodospirillales（紅螺菌目）、Saprospirales（腐生螺目）、Syntrophobacterales（互營桿菌目）、Xanthomonadales（黃色單胞菌目）等。不同輪作處理影響了土壤細菌群落組成，如喜酸性菌Acidobacteriales在輪作空心菜處理中含量最高，對照次之，而輪作莧菜處理含量最低；Bacillales是對病原菌有拮抗作用的有益細菌，Nitrospirales具有硝化的作用（Pennisi，2004），這2種有益菌在輪作莧菜處理中的含量分別比對照提高了9.06%、34.1%。Actinomycetales的含量表現為對照低于各輪作處理，而Rhizobiales的含量則反之。

2.3.2 土壤真菌群落結構變化 由圖2可知，處理土壤共有8個優勢真菌屬（相對豐度＞1%，其余為others），包括：Aspergillus（土曲霉屬）、Chaetomium（毛殼菌屬）、Cladosporium（枝孢屬）、Fusarium（鐮孢菌屬）、Myceliophthora（毀絲霉屬）、Penicillium（青霉屬）、Sordaria（糞殼屬）、Thielavia（梭孢殼屬）。不同輪作處理影響了土壤真菌群落組成，除了大白菜輪作處理，對照中的Fusarium豐度明顯高于各輪作處理。輪作莧菜與芥菜處理的Penicillium和Sordaria含量明顯高于對照。

圖1 不同輪作處理下土壤細菌目水平的群落結構

圖2 不同輪作處理下土壤真菌屬水平的群落結構

3 討論

3.1 不同輪作處理對豇豆連作地的土壤養分影響

土壤酸化是連作障礙發生的主要原因之一，因此提高土壤的pH或減緩土壤的酸化成為克服連作障礙的重要措施之一（肖新 等，2015）。研究表明，茄子和香蕉輪作可以在一定程度上提高連作土壤pH和土壤有機質含量，減輕連作帶來的危害（洪珊，2017）。本試驗條件下，輪作莧菜可以顯著提高連作豇豆土壤的pH值，有機質含量顯著提高20.92%，但土壤全氮含量與對照差異不顯著，可能是由豇豆根瘤菌的固氮作用所致。在速效養分方面，鄭超等（2003）認為合理的輪作模式可以增加土壤有機質和土壤養分含量，加速速效養分的釋放。本試驗中，葉菜輪作處理的土壤速效養分比對照有所增加，其中輪作莧菜處理后土壤的堿解氮、速效磷含量最高，均顯著高于對照。

3.2 不同輪作處理對豇豆連作地微生物特性的影響

土壤微生物生物量是衡量土壤質量、維持土壤肥力和作物生產力的一個重要指標（Wang et al.，2015）。研究表明，長期種植單一作物容易導致土壤中養分失衡（姜佰文 等，2014），作物根際微環境破壞（顧大路 等，2016），微生物群落結構改變（Kintché et al.，2015）。通常，土壤中微生物多樣性增加有利于提高土壤的多功能性和可持續性（Wagg et al.，2014）。孟令波等（2017）研究表明，芥菜與茄子輪作后的土壤微生物群落結構發生了變化，輪作后土壤中有益細菌豐度增加，緩解了茄子連作障礙，能夠有效防控茄子的土傳病害。本試驗中，不同輪作處理影響了土壤微生物的群落結構與微生物多樣性，輪作莧菜和芥菜后，土壤細菌OTU數和Chao1指數明顯高于連作土壤，說明輪作莧菜和芥菜有助于提高土壤細菌的豐度。研究發現，土壤中Actinomycetales細菌可以抑制土傳病原體繁殖，克服連作導致的土傳病害和土壤酸化等弱化作用。本試驗中各輪作處理的土壤中Actinomycetales相對豐度都有所上升，說明輪作能一定程度減緩土壤的連作危害（應益昕，2013）。Acidobacteriales與土壤pH呈負相關，喜酸性土壤（Griffiths et al.，2011）。本試驗結果顯示，除了與空心菜輪作后Acidobacteriales的豐度發生了上升，其余各處理都發生了不同程度的下降，同時發現各處理的Acidobacteriales相對豐度與各處理的土壤pH成負相關，輪作莧菜后Acidobacteriales豐度最低表明輪作莧菜減緩了土壤的酸化。同時對照Rhizobiales的豐度高于各輪作處理，可能是因為豆科植物的根瘤菌在植株生長期間發揮了一定的作用。

不同葉菜輪作后土壤細菌群落發生了變化，同時真菌群落結構也發生了改變。本試驗在MiSeq高通量測序結果中共鑒定出8個優勢真菌菌屬（圖2）。趙娜等（2014）的盆栽試驗結果表明，與茄子輪作能顯著降低枯萎病蕉園土壤中Fusarium的數量。本試驗中，與豇豆連作相比，除了與大白菜輪作后Fusarium含量出現了上升，其他處理的土壤Fusarium豐度均降低，有利于減緩土傳病帶來的危害。趙存鵬等（2017）發現糧棉輪作可以增加土壤中Sordaria的豐度，提高土壤肥力；王芳等（2013）研究表明Penicillium對尖孢鐮刀菌具有較好的抑制作用。本試驗中，Sordaria和Penicillium在輪作莧菜和芥菜后出現了明顯的上升，表明莧菜輪作提升了有益菌的豐度，提高了微生物多樣性，與番茄輪作的研究結果相類似（楊尚東 等，2016）。

4 結論

本試驗結果表明，豇豆輪作葉菜不僅能夠提高土壤肥力，而且能夠提高土壤細菌群落的豐度和真菌群落的多樣性，有利于保持土壤微生物群落結構的穩定。在菜心、莧菜、空心菜、芥菜和大白菜5種葉菜中，莧菜輪作對豇豆連作土壤的肥力及微生物群落結構改善效果最好。