應用超高效液相色譜質譜聯用技術測定漢桃葉不同部位中有三種機酸的含量

洪艷 李莎 韓笑

【摘 要】目的：建立應用超高效液相色譜串聯質譜聯用儀（UPLC-MS/MS）測定漢桃葉不同極性部位中反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸的含量。方法：樣品用甲醇-水混合溶液溶解，以乙腈-水為流動相，流速為0.25 mL/min，在柱溫30 ℃的條件下，采用負離子多反應監測（MRM）模式進行檢測。結果表明，反式二烯酸、琥珀酸、蘋果酸在各自濃度范圍內線性關系良好;反式二烯酸和蘋果酸的檢測限為500ng/ml， 琥珀酸的檢測限為100ng/ml。加樣回收率為91.8%～95.4%，相對標準偏差為3.2%～4.4%。該方法是一種靈敏度高、準確度較高的測定反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸的方法，可以應用于其他中藥材中這三種有機酸的檢測。

【關鍵詞】漢桃葉;提取;分離;超高效液相色譜-質譜聯用技術 ;有機酸;物質基礎

【中圖分類號】? R249? 【文獻標識碼】 B【文章編號】 1672-3783（2019）05-03-022-01

漢桃葉為五加科植物白花鵝掌柴（Scheffiera kwang siensis Merr.ex Li）的根或莖、葉，又名廣西鵝掌柴，產于貴州[1]。漢桃葉具有祛風止痛，舒筋活絡之功效。用于治療三叉神經痛，坐骨神經痛、風濕關節痛[2]，目前被做成多種中藥制劑上市，如漢桃葉膠囊，漢桃葉片等，應用較廣[2]。目前漢桃葉化學成分中有機酸類成分被認是藥效作用成分[3-5]，然而有機酸類成分極性較大，含量少，因此應用常規高效液相色譜技術同時定量幾種有機酸難度較大[6-7]。本論文利用層析技術對漢桃葉進行分離得到不同極性部位，并采用超高效液相色譜質譜聯用技術建立了對漢桃葉中三種代表性的有機酸-富馬酸、琥珀酸和蘋果酸的含量測定的方法，最終應用此技術對不同極性部位中的三種有機酸的含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT 25S型電子天平（德國賽多利斯有限公司）、Water Acquity I-class UPLC型液相色譜儀（美國沃特世公司）、Xevo TQ-S型串聯質譜儀（美國沃特世公司）;

1.2 試藥 液相用乙腈（美國西格瑪有限公司）、液相用水為娃哈哈純凈水（中國娃哈哈有限公司）。乙醇、甲醇等試劑均為分析純或實驗室常用規格;Hp20大孔樹脂（日本日立公司， 批號7G504）;

反丁烯二酸對照品（中國藥品生物制品檢定所， 批號：123049）;琥珀酸對照品（中國藥品生物制品檢定所， 批號：190014）;蘋果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所， 批號：110896）;本研究所使用的漢桃葉藥材由金鴻藥業股份有限公司提供。

2 方法

2.1 漢桃葉不同部位的富集 取漢桃葉藥材1kg，用70%乙醇提取兩次，過濾，回收醇提液，藥渣干燥，后按照藥典中水提醇沉方法再次提取藥渣，得到水提液。將醇提液與水提液合并，濃縮干燥得到浸膏粉末100g。取漢桃葉浸膏粉末65g，將其完全溶解于300ml的去離子水中，上樣至Hp20大孔吸附樹脂，依次用3倍柱體積的水、10%、20%、30%、50%、75%和95%乙醇依次洗脫， 50℃減壓濃縮至干浸膏，后凍干至干燥粉末，得到水洗脫部位（20.8g， 32%），10%乙醇洗脫部位（3.2g， 4.9%），20%乙醇洗脫部位（5.5g， 8.4%），30%乙醇洗脫部位（4.2g， 6.4%），50%乙醇洗脫部位（10.3g， 15.8%），75%乙醇洗脫部位（2.3g， 3.5%），95%乙醇洗脫部位（0.67， 1.0%）。

2.2 溶液的配置

2.2.1 樣品的制備 稱取漢桃葉各部位樣品20mg于10ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，得2mg/ml樣品溶液，過0.22 μm的微孔濾膜后直接進樣檢測。

2.2.2 標準儲備溶液的配制

分別稱取富馬酸、琥珀酸標準品10mg于50ml容量瓶中，蘋果酸標準品10mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別得到0.2mg/ml，0.2mg/ml，1mg/ml溶液。

2.2.3 混合標準使用溶液的配制

分別取適量的對照品儲備液至20ml量瓶中，根據稀釋比例，用甲醇依次稀釋至標準曲線所需的各濃度。繪制標準曲線，外標法定量。

2.3 色譜質譜條件

2.3.1 液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.7 μm 粒徑，2.1 mm i.d × 50 mm）;流動相A和B分別為水和乙睛;流動相流速為 0.25mL·min-1。梯度洗脫條件為：0-1.2 min，5～19%B;1.2-4.2min，19～95%B; 4.2- 6.2min 95%～5%B。柱溫：30 ℃，進樣體積：5 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源：負離子模式;干燥氣（氮氣）流速：12 L·min-1，離子源溫度：350 ℃，霧化器（氮氣）壓力：45 psi，毛細管電壓：3 kV;數據采集方式多反應監測（MRM）模式檢測;各化合物檢測條件見表1。

3 結果與討論

3.1 線性范圍和檢出限 分別將2.2.3項下配制好的混標溶液按照所建立的方法進行檢測。分別以蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的濃度為橫坐標，色譜峰面積離子的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程。如表2所示，蘋果酸在0.5～100μg/mL 濃度，反丁烯二酸在0.5～100μg/mL 濃度，琥珀酸在0.1～10μg/mL 濃度范圍內線性良好（r2>0.99）。以3 倍信噪比作為檢出限， 10 倍信噪比作為定量限。結果顯示蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的儀器檢測限分別為0.16 μg/ml 和0.16 μg/ml和0.045μg/ml; 對應的方法定量限為0.5 μg/ml 和0.5 μg/ml和0.1μg/ml。

3.2 回收率和批內精密度 選擇水洗脫部位為加樣回收率的樣品，分別在樣品中加入含有蘋果酸，反丁烯二酸和琥珀酸86.5，356.9，1.0μg的樣品溶液，每個濃度制備兩份樣品，計算加標回收率和精密度，結果見表3。如表2所示，蘋果酸加標樣品的平均回收率分別為94.2%、反丁烯二酸為91.8 %，琥珀酸為95.4 %， 相對標準偏差分別為3.2%、4.4%和3.7%， 結果證明該方法具有較好的回收率和精密度。

3.3 漢桃葉不同洗脫部位有機酸含量的測定 對分離富集得到的漢桃葉不同提取部位中蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的含量進行測試，結果表明蘋果酸和反丁稀二酸在水洗脫部位中的含量較高，為4.32mg/g和17.84mg/g。而琥珀酸在各部位中含量均較少，均小于0.1mg/g。

4 結論

本文首次建立了利用UPLC-MS/MS靈敏、準確的測定漢桃葉不同部位中蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸含量的方法。方法在負離子模式下，應用多反應離子檢測，得到蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的定量限分別為0.5 μg/ml 和0.5 μg/ml和0.1μg/ml。應用此方法，蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的回收率91.8～95.4%， 滿足方法學要求。本文應用此方法對漢桃葉不同部位中有機酸的含量進行測試，發現水洗脫部位中有機酸含量較高，為漢桃葉藥效部位的確定提供依據。

參考文獻

[1] 上海中藥一廠技術組， 漢桃葉有效成分的研究， 中成藥研究， 1978， 3， 6-11.

[2] 中國藥典（2015年版一部）. 北京： 化學工業出版社， 2015： 812.

[3] 徐杰， 漢桃葉的化學成分研究， 湖南中醫藥大學碩士學位論文， 2006.

[4] 潘力，廖厚知，齊艷輝，HPLC測定漢桃葉中反丁烯二酸的含量，遼寧中醫雜志，2012， 39（5）：906-907

[5] 倪開勤，高效液相色譜法測定漢桃葉中有效成分含量，醫藥導報， 2013，32（8）： 1097-1098.

[6] 徐劍， 張永萍， 漢桃葉藥材含量測定方法的研究， 貴陽中醫學院學報，2008，30（2）： 75-77

[7] 胡書平，漢桃葉有機酸類成分研究及軟膏劑開發，中央民族大學碩士學位論文， 2012.