胰蛋白酶提取豬皮中明膠的工藝優化

張云鳳，李嘉敏，王 平

（太原工業學院化學與化工系，山西太原030008）

隨著世界經濟的快速發展，消耗的能源也越來越多，其中生物資源是一種優質的清潔能源，需要我們加大力度不斷開發，將可以利用的清潔能源充分應用到我們的生活中[1]。明膠作為膠原的水解產物，是一種可再生的動物生物質清潔能源，資源量正在不斷增加[2]。

然而傳統堿法提取制備明膠的工藝，在生產過程中的體系衛生標準控制較為困難，生產時間較長，同時設備較難更新改進，不符合綠色節能生產工藝的大環境要求[3]。酶法提取明膠雖然發展時間較短，卻在相關的國內外研究中取得較大成果，雖然到目前為止還沒能大范圍應用于工業生產中，不過其提取時間較短，設備及反應體系更環保及易控制，將是未來明膠提取工藝的重要發展方向[4]。因此，對酶法提取明膠的相關工藝進行探討和總結具有一定的研究意義和實用價值。

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

豬皮；胰蛋白酶（阿拉丁試劑公司）；明膠（阿拉丁試劑公司）；其他試劑均為分析純。

FA2104 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；JB300D 型強力電動攪拌機（上海標本模型廠）；恒溫水浴鍋（嘉興俊思電子有限公司）；TU190 型雙光束紫外可見分光光度計（北京譜析通用儀器有限責任公司）；Spectrum 100 型FT-IR 紅外（北京譜析通用儀器有限責任公司）。

1.2 豬皮的預處理

將新鮮豬皮洗凈，去除豬皮上帶有的脂肪，隨后將洗凈的新鮮豬皮切成1 cm×1 cm 小塊，使用濃度為2 mol/L 的氯化鈉溶液于1 000 mL 的燒杯中持續攪拌24 h，以除去豬皮中所含的鹽溶性及其他可溶性雜質，取出后用去離子水清洗數次；再將處理后的豬皮在丙酮溶液里浸泡12 h 以去除豬皮中的脂類物質[1]，浸泡之后取出并將其清洗干凈，放在室溫下自然風干，待用。

1.3 明膠標準曲線的繪制

分別精密稱取0.500 0、1.000 0、1.500 0、2.000 0 和2.500 0 g 的明膠標準品，在75℃的水浴中溶解于0.5 mol/L 醋酸溶液中，轉移至25 mL 的容量瓶中并用0.5 mol/L 的醋酸溶液定容，即分別得到濃度為2%、4%、6%、8%、10%的明膠標準溶液，單位為g/mL。取上述已配制好的溶液，以醋酸溶液為空白樣，在波長280 nm 處使用紫外分光光度計進行測試[5]。以膠原濃度為橫坐標，以280 nm 處的吸光度值為縱坐標繪制吸光度曲線，得到回歸曲線方程。

1.4 胰蛋白酶法提取豬皮中的明膠

將處理后的豬皮浸泡于醋酸溶液中，加入胰蛋白酶，升溫反應，酶解，然后，一定溫度下提取明膠。提取過程中，溶液中明膠的濃度采用標準曲線法進行測定，根據測試的濃度與溶液體積的乘積比上實驗開始時用到的干豬皮重量即得明膠的得率。

明膠的得率Yc由以下公式計算得到：

其中，Vc是明膠提取液的體積，mL；Cc是通過紫外法測得的明膠提取液的濃度，g/mL；Wt是提取使用的干豬皮的重量，g。

1.5 單因素實驗步驟

本文探討的單因素為胰蛋白酶的用量、酶解時間、酶解溫度、溶膠溫度。

1.5.1 胰蛋白酶用量

稱取4 份8 g 干豬皮加入到0.5 mol/L 醋酸溶液中，加入胰蛋白酶的用量分別為0.08 g、0.16 g、0.24 g、0.32 g，調節溶液pH 為7 左右，在35℃的水浴中攪拌12 h，后調節pH 為2～3，反應2 h，使其鈍化，再調節pH 到7左右，升高溫度到75℃溶膠6 h，用濾布進行過濾，去除未反應完全的豬皮殘渣，用離心機離心后取上層清液于比色皿中，根據標準曲線方程求出胰蛋白酶不同用量下干豬皮中明膠的提取率。據此確定酶解溫度為35℃，酶解時間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下的最優胰蛋白酶用量。UV 測試同1.3。

1.5.2 酶解時間

酶解時間分別12 h、24 h、36 h、48 h，采用1.5.1 的方法確定胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，溶膠溫度為75℃條件下的最優酶解時間。

1.5.3 酶解溫度

酶解溫度為15℃、25℃、35℃、45℃的水浴條件下，采用1.5.1 的方法確定胰蛋白酶用量為0.16 g，酶解時間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下的最優酶解溫度。

1.5.4 溶膠溫度

溶膠溫度為70℃、75℃、80℃、85℃的條件下，采用

1.5.1 的方法確定胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，酶解時間為24 h 條件下的最優溶膠溫度。

1.6 正交實驗優化工藝

通過對單因素的結果進行分析，將對明膠產率影響較大的因素進行正交優化，然后按照正交優化結果進行實驗驗證。

1.7 紅外測試

打開紅外測試儀的開關并預熱0.5 h 左右，將實驗所得明膠溶液小心地滴在樣品板上，蓋住蓋子掃描譜圖，得到譜圖后保存，完成后將檢測口用棉花沾取工業乙醇擦洗干凈[6]。仔細分析所得譜圖，得出結論。

2 結果與分析

2.1 明膠標準曲線的繪制

通過實驗得到明膠濃度為2%、4%、6%、8%、10%的標準溶液吸光度A，用0.5 mol/L 醋酸溶液作為空白對照，得出表1 數據。

以吸光度A 為縱坐標，濃度C 為橫坐標，用最小二乘法進行線性回歸，得出明膠吸光度A 與濃度C 的關系曲線的回歸方程式為y=1.42x+0.009 8，R2=0.998 5。

表1 標準曲線數據

圖1 明膠吸光度A 與濃度C 的標準曲線

2.2 胰蛋白酶用量對工藝的影響

酶解溫度為35℃，酶解時間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下，改變酶的用量進行實驗，所得結果如表2。

表2 不同胰蛋白酶用量的提取率

圖2 不同胰蛋白酶用量的明膠提取率

圖2為不同胰蛋白酶用量的明膠提取率曲線，由圖2 可以看出，明膠提取過程中保持酶解溫度、酶解時間及溶膠溫度一定的情況下，胰蛋白酶用量為0.24 g，即豬皮干重3%（g/g）時明膠的提取率最為理想，在酶濃度較低時酶解效果不理想，當酶濃度過高時提取率也降低。

2.3 酶解時間對工藝的影響

胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，溶膠溫度為75℃條件下，改變酶解時間進行實驗，所得結果如表3。

表3 不同酶解時間的提取率

圖3 不同酶解時間的明膠提取率

圖3為不同酶解時間的提取率曲線，由圖3 可知：提取過程中保持胰蛋白酶用量、酶解溫度及溶膠溫度一定的情況下，加入胰蛋白酶后反應時間為24 h 時明膠的提取率最為理想，這是由于酶解時間太短，反應進行不完全；而酶解時間過長，可能會使膠原纖維遭到破壞。

2.4 酶解溫度對工藝的影響

胰蛋白酶用量為0.16 g，酶解時間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下，改變酶解溫度進行實驗，所得結果如表4。

表4 不同酶解溫度的提取率

圖4 為不同酶解溫度的提取率曲線，由圖4 可知：保持胰蛋白酶用量、酶解時間及溶膠溫度一定的情況下，當酶解溫度為35℃時明膠的提取率最為理想，可能是胰蛋白酶在這個溫度下活性最高。

2.5 溶膠溫度對工藝的影響

胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，酶解時間為24 h 的條件下，改變溶膠溫度進行實驗，所得結果如表5。

圖4 不同酶解溫度的明膠提取率

表5 不同溶膠溫度的提取率

圖5 不同溶膠溫度的明膠提取率

由圖5 不同酶解溫度的提取率曲線分析可以得出：保持胰蛋白酶用量、酶解時間及酶解溫度一定的情況下，溶膠溫度為80℃時明膠的提取率最為理想。

2.6 正交實驗優化

通過對單因素實驗結果的分析，對四個因素中對產率有較大影響的水平進行正交實驗，正交助手共提供了九組組合實驗，實驗條件排列如表6，實驗數據如表7。

由以上分析結果可以看出，在胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，酶解時間為24 h，溶膠溫度為80℃時，溶液的紫外吸光度A 為0.084，溶液明膠濃度為0.052 2 g/mL，胰蛋白酶對干豬皮的明膠的提取率為67.28%。

2.7 明膠的紅外譜圖和分析

紅外光譜能充分反映官能團與波長的關系，其實質是一種根據分子內部原子間的相對振動和分子轉動等信息來確定物質分子結構和鑒別化合物的分析方法[7]。明膠的FT-IR 譜圖可以反映蛋白質骨架和側鏈基團的特征吸收峰位置及基團的振動模式，并由此推測其構象[8]。

表6 正交實驗排列表

表7 正交實驗下的提取率

圖6 明膠標準品的紅外譜圖

明膠標準品的紅外譜圖如圖6，由圖6 可知：在標準圖中，明膠有四個特征吸收峰，分別為3 295 cm-1，2 927cm-1，1 636～1 661 cm-1和1 450～1 230 cm-1，他們分別對應酰胺A 帶、酰胺B 的N-H 伸縮振動，酰胺I 的C=O 伸縮，酰胺Ⅱ的C-N 伸縮、N-H 彎曲[7]。圖7 為明膠產品的紅外譜圖，由圖7 可以看出，3 366 cm-1和2 928 cm-1附近是N-H 伸縮振動，1 638 cm-1附近是酰胺I 帶的C=O 伸縮振動，1 257cm-1是N-H 彎曲振動[7,9]，說明產品為明膠。

圖7 明膠產品的紅外譜圖

3 結論

本實驗采用胰蛋白酶法提取明膠，研究了胰蛋白酶用量、酶解時間、酶解溫度及溶膠溫度四個單因素對明膠提取率的影響，并對影響提取率較大的因素進行正交實驗，確定最優的工藝條件為：酶用量為3%，酶解時間12 h，酶解溫度35℃，溶膠溫度80℃，該條件下明膠提取率為67.28%。