添加Triton X-100 提高Streptococcus equisimilis FE-11 發(fā)酵透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的研究

劉金龍，李志敏 ，趙國(guó)群，孫錫友 ，任媛媛

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050000）

透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸與N- 乙酰氨基葡萄糖組成的雙糖單位重復(fù)連接而成的生物多糖，分子量顯著影響其理化性質(zhì)和應(yīng)用效果。高分子量透明質(zhì)酸具備優(yōu)異的保濕性、粘彈性以及潤(rùn)滑作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域[1-2]。微生物發(fā)酵法是目前透明質(zhì)酸的主要生產(chǎn)方法，但是在工業(yè)生產(chǎn)中如何實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量的同時(shí)保證高分子量仍是一個(gè)難題，實(shí)際上附加值較高的高分子量透明質(zhì)酸產(chǎn)品，占發(fā)酵總產(chǎn)量的比例并不高[3]。為解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞高分子量透明質(zhì)酸的合成機(jī)制，從不同角度和層次展開(kāi)研究。

已有報(bào)道證明微生物培養(yǎng)環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)條件顯著影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的高低。溶氧水平對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量影響顯著，較高的溶氧水平有利于高分子量透明質(zhì)酸的高效合成，但發(fā)酵體系較高的攪拌轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力會(huì)對(duì)透明質(zhì)酸合成產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而影響透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量；另外高溶氧衍生的氧自由基也會(huì)對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量產(chǎn)生不利影響[4]。Jagannath 等研究證實(shí)培養(yǎng)溫度是影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的另一個(gè)顯著因素，低溫環(huán)境不利于菌體生長(zhǎng)，但卻有利于高分子量透明質(zhì)酸的合成[5]。此外，Pires 研究團(tuán)隊(duì)的報(bào)道證實(shí)較高濃度的碳源以及添加前體物質(zhì)有利于高分子量透明質(zhì)酸的合成，但較高濃度有機(jī)氮源會(huì)導(dǎo)致透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的下降[6]。

除了培養(yǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件，微生物發(fā)酵生產(chǎn)胞外產(chǎn)物的效率往往受到細(xì)胞膜通透性的制約，增大細(xì)胞膜通透性可以降低胞外產(chǎn)物的分泌阻力，促進(jìn)產(chǎn)物的跨膜運(yùn)輸，解除產(chǎn)物反饋抑制效應(yīng)，提高產(chǎn)物的合成效率[7-8]。透明質(zhì)酸是典型的細(xì)菌胞外多糖，其胞內(nèi)合成與向胞外分泌過(guò)程在時(shí)空上緊密關(guān)聯(lián)。透明質(zhì)酸糖鏈在胞內(nèi)合成的同時(shí)，向胞外分泌延伸，而其跨膜分泌延伸的過(guò)程受到細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性的制約，因此透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量與細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性緊密相關(guān)[9]。為了提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量，本文系統(tǒng)考查了表面活性物質(zhì)Triton X-100 添加濃度、添加時(shí)機(jī)對(duì)Streptococcus equisimilis FE-11 發(fā)酵透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響，確定了最優(yōu)的添加策略，并在此基礎(chǔ)上比較了Triton X-100 添加與否對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組成的影響，印證了細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性對(duì)透明質(zhì)酸合成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

本研究采用的菌株Streptococcus equisimilis FE-11由河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

腦心浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，氯化鈉5 g/L，K2HPO42.5 g/L，自然pH，瓊脂20 g/L，121℃滅菌15 min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO42 g/L，調(diào)pH=7.0，121℃滅菌15 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（三角瓶）

葡萄糖60 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO410 g/L，調(diào)pH=7.0，121℃滅菌15 min。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（發(fā)酵罐）

葡萄糖60 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO42 g/L，調(diào)pH=7.0，121℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將1～2 環(huán)斜面種子培養(yǎng)物接種至裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速250 rpm，溫度37℃，培養(yǎng)12～14 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)（三角瓶）

將5 mL 種子培養(yǎng)液接種至裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（三角瓶）的500 mL 三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速250 rpm，溫度37℃，培養(yǎng)24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)（發(fā)酵罐）

5 L 發(fā)酵罐中添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積為4 L，接種量為5%（V/V），溫度37℃，通氣量4 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為400 rpm，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)流加氫氧化鈉溶液控制pH=7。

1.4 菌體濃度的測(cè)定

采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法，將發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，在波長(zhǎng)660 nm 處測(cè)其吸光度OD 值，根據(jù)吸光度與細(xì)胞干重關(guān)系式求得菌體濃度。

1.5 脂肪酸測(cè)定

采用Folch 法提取細(xì)胞膜磷脂，提取的磷脂經(jīng)0.5 mol/L KOH-CH3OH 溶液皂化，然后在三氟化硼催化作用下進(jìn)行甲酯化修飾，隨后利用正己烷萃取甲酯化產(chǎn)物，萃取樣品采用Sun 等人報(bào)道的方法進(jìn)行脂肪酸分析測(cè)定[10]。

1.6 透明質(zhì)酸濃度測(cè)定

采用Bitter-Muir 氏法測(cè)定透明質(zhì)酸濃度[11]。

1.7 透明質(zhì)酸相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用Laurent 特性粘度法測(cè)定透明質(zhì)酸相對(duì)分子質(zhì)量[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Triton X-100 添加濃度對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的影響

圖1 Triton X-100 添加濃度對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)S. equisimilis FE-11 發(fā)酵體系中添加表面活性劑Triton X-100 可以顯著影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量。如圖1 所示，在發(fā)酵初始階段，向透明質(zhì)酸的發(fā)酵體系中添加一定量的Triton X-100，考查其添加濃度對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響。在Triton X-100 添加終濃度從1 g/L 逐步上升至7 g/L 過(guò)程中，透明質(zhì)酸分子量和產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)添加終濃度為3 g/L 時(shí)，透明質(zhì)酸分子量和產(chǎn)量同時(shí)達(dá)到最高值，分別為1.98 MDa 和1.12 g/L。

2.2 Triton X-100 添加時(shí)機(jī)對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的影響

Triton X-100 對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響除了與添加濃度有關(guān)外，還與添加時(shí)機(jī)相關(guān)。為了考查Triton X-100添加時(shí)機(jī)對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響，將Triton X-100 以不同時(shí)間（第0 h、4 h、8 h、12 h、16 h）添加到透明質(zhì)酸發(fā)酵體系中時(shí)，添加終濃度均為3 g/L，如圖2 所示，透明質(zhì)酸分子量呈現(xiàn)出先增加后下降的變化趨勢(shì)，最高分子量出現(xiàn)在添加時(shí)間為4 h，達(dá)到了2.18 MDa；另一方面，透明質(zhì)酸產(chǎn)量受Triton X-100 添加時(shí)機(jī)的影響，也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在添加時(shí)間為8 h 時(shí)，達(dá)到了1.23 g/L。

Triton X-100 對(duì)于S. equisimilis FE-11 發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的影響效果受到添加濃度和添加時(shí)機(jī)的雙重制約，對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量促進(jìn)效果最好的添加時(shí)機(jī)發(fā)生在發(fā)酵過(guò)程的前半段。為了更為全面考查Triton X-100 對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響，進(jìn)一步系統(tǒng)比較了不同添加時(shí)機(jī)（第0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）和不同添加濃度（0 g/L、1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L）對(duì)應(yīng)的透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量隨著Triton X-100 添加時(shí)機(jī)和添加濃度變化而變化，二者變化趨勢(shì)基本一致，并且Triton X-100 添加時(shí)機(jī)越早，透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的最高值對(duì)應(yīng)的Triton X-100 添加濃度越??；當(dāng)添加時(shí)機(jī)較早時(shí)（第0 h 和2 h），透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的最高值對(duì)應(yīng)的Triton X-100 添加濃度均是3 g/L；當(dāng)添加時(shí)機(jī)為第4 h 和6 h時(shí)，透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的最高值對(duì)應(yīng)添加濃度均是5 g/L；當(dāng)添加時(shí)機(jī)為第8 h 和10 h 時(shí)，透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的最高值對(duì)應(yīng)添加濃度均為7 g/L；在全部實(shí)驗(yàn)批次中，透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的最高值同時(shí)出現(xiàn)在當(dāng)Triton X-100 添加濃度5 g/L，添加時(shí)機(jī)為第6 h 時(shí)，分別達(dá)到了1.35 g/L 和2.33 MDa。

圖2 Triton X-100 添加時(shí)機(jī)對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響

表1 Triton X-100 添加濃度和添加時(shí)機(jī)對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響

2.3 5 L 發(fā)酵罐水平添加Triton X-100 對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)添加Triton X-100 對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的影響，在5 L 發(fā)酵罐水平上進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖3 所示，在發(fā)酵第6 h 添加Triton X-100 至5 g/L，與不添加Triton X-100 相比，透明質(zhì)酸最終產(chǎn)量和分子量分別從3.65 g/L 和1.93 MDa 提高到4.21 g/L 和2.49 MDa，分別提高了15.34%和29.02%。

圖3 5L 發(fā)酵罐水平添加Triton X-100 對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響

向微生物培養(yǎng)體系中加入表面活性劑可以改善微生物細(xì)胞的通透性，進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)的分泌和合成，這主要是由于表面活性物質(zhì)改變了微生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性[7-8]。微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率很大程度上決定著細(xì)胞膜的流動(dòng)性，二者比率越小，細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性越強(qiáng)[8,12]。Nelmec 等在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶的過(guò)程中，添加Tween-80 顯著降低了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率，多聚半乳糖醛酸酶的產(chǎn)量提高了70%[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，Triton X-100 的加入引起了S.equisimilis FE-11 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比率的變化。如表2 所示（脂肪酸種類由碳原子數(shù)∶不飽和鍵數(shù)表示），與不添加Triton X-100 相比，在發(fā)酵第6 h 添加5 g/L Triton X-100 引起S. equisimilis FE-11 細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化：不飽和脂肪酸C14∶1，C16∶1，C18∶1，C18∶2 均出現(xiàn)不同程度的升高，而飽和脂肪酸C12∶0，C14∶0，C16∶0，C18∶0 均出現(xiàn)不同程度的降低，由此導(dǎo)致飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率從0.80 降低至0.50，這一變化誘發(fā)了S. equisimilis FE-11 細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性的改變，促進(jìn)了長(zhǎng)鏈透明質(zhì)酸的跨膜分泌與合成，一定程度上揭示了Triton X-100 對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量影響的內(nèi)在誘因。

表2 添加Triton X-100 對(duì)S. equisimilis FE-11 細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

3 結(jié)論

Triton X-100 添加對(duì)S.equisimilis FE-11 發(fā)酵透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的影響效果與添加量和添加時(shí)機(jī)相關(guān)；發(fā)酵第6 h 添加Triton X-100 至5 g/L 可使透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量同時(shí)達(dá)到最高水平；5 L 發(fā)酵罐驗(yàn)證結(jié)果表明，該添加策略使透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量分別提升了15.34%和29.02%；透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的提升伴隨菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率而下降；Triton X-100 添加引起的菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，改善了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，促進(jìn)了透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量的提高。