IRP患者骨髓單個核細胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA表達研究

陳龍 范麗萍 張永為 王劍超

免疫相關性全血細胞減少癥（immune- related pancytopenia，IRP）是近年來新認知的一類骨髓衰竭性疾病，臨床上常表現為二系或二系以上的血細胞減少，但其不同于其它已經認知的骨髓衰竭性疾病，IRP 主要特征是由于骨髓造血細胞表面產生了自身抗體，影響了造血細胞的分化發育，從而引起外周血細胞減少。該類患者外周血抗人球蛋白試驗（COOMBS試驗）呈陰性，但骨髓單個核細胞 COOMBS 試驗或流式細胞技術均能檢測到造血細胞自身抗體的存在。國內許多學者已對IRP疾病發病機制進行了初步研究［1］，發現IRP患者的B淋巴細胞數量、亞群、功能存在異常，尤其當T細胞活化異常介導的 B1群（CD5+的B細胞）數量增多，功能亢進可能是產生抗骨髓未成熟造血細胞自身抗體的主要原因［2-3］，但影響T細胞活化和分化的 CD28/B7 家族共刺激分子在IRP中是否存在表達異常尚不明確，有必要進一步分析討論。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集本院2010年10月至2016年10月間門診和住院患者確診為IRP患者骨髓樣本20例及20例陰性對照骨髓樣本，考慮到臨床可行性和較易獲取可能性，擬采用診斷為缺鐵性貧血（IDA）患者骨髓樣本20例作為陰性參照（IDA是一種單純的缺鐵性貧血，其生理生化性質與正常人基本相同）。40例樣本均來自浙江中醫藥大學附屬第二醫院血液科收治并經臨床確診患者，年齡33～82歲，中位年齡58歲，男女比3∶2，患者本身無嚴重基礎疾病，所有樣本采集均征得患者本人同意下獲得。IRP患者入選標準：（1）患者外周血呈一系、二系或全血細胞減少；（2）患者骨髓中紅系細胞比例不低，或骨髓象可見“紅系造血島”；（3）能夠明確獨立不同于其他各類血液或骨髓衰竭疾病；（4）骨髓單個核細胞 Coomb's 試驗陽性；（5）臨床免疫抑制療法對其有效。

1.2 實驗試劑 Ficoll 密度梯度離心液、Trizol 試劑盒、氯仿、無水乙醇、DEPC 水、TaqDNA 聚合酶、PrimeScript TMΠ 1st-strand cDNA Synthesis kit、SYBR Green Master kit、β-action 質粒標準品、5× Reverse Tan-scriptase M-MLV Buffer 、10x 細胞裂解液、CTLA-4'CD28'CD80'CD86mRNA 探針及引物合成、RPMI1640培養液。

1.3 實驗方法與觀察指標 40例骨髓樣本均采用EDTA抗凝管采樣2ml，用30μm尼龍濾網過濾掉骨髓中的細胞團塊及凝塊，然后采用 Ficoll 密度梯度離心法分離BM-MNCs，將各組分離出來單個核細胞進行顯微鏡計數細胞總數，然后用RPMI1640培養液調整細胞濃度，將40例骨髓樣本中單個核細胞處于同一細胞濃度約3×104/μl，然后每個樣本各取200μl按Trizol 試劑說明書操作過程提取每個樣本的總 RNA，按 RNA 逆轉錄試劑盒說明書操作將總 RNA 逆轉錄為 cDNA，cDNA 樣本-80℃保存。設計相應的PCR反應體系，進行目標基因的循環擴增指標檢測。采用 RTPCR 擴增儀分析軟件，以空白對照作為標準基線，參考標準品相應濃度形成的擴增曲線來換算待測樣本中每個目的基因的表達含量，采用相對定量的方法，用內參基因（actin-β）將目的基因（CTLA-4，CD28，CD80，CD86）校正至 108copies/ml，用目的基因校正值的拷貝數取對數值為最終有效數據來進行統計分析。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用配對t檢驗，以 P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

IRP患者組和IDA對照組骨髓單個核細胞中CTLA-4、CD28、CD80、CD86mRNA表達見表1。

表1 IRP和IDA骨髓單個核細胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA的表達［copies/ml，（x±s）］

3 討論

目前認為IRP作為一類骨髓方面的血液系統疾病，其主要特點是此類疾病患者的骨髓造血細胞表面存在自身抗體（而在外周血中細胞表面未檢測到自身抗體），骨髓造血細胞表面的自身抗體在髓內直接引起破壞或抑制造血細胞，導致骨髓造血功能減退或無效造血，從而引起患者外周血中全血或二系細胞減少，關于IRP的發病機制的研究，目前主要的研究認為IRP是由于T淋巴細胞（TH）調控失衡導致B淋巴細胞（CD5+）數量、亞群、功能異常，從而引起患者骨髓中免疫調節紊亂，免疫平衡破壞，骨髓中造血前體血細胞表面抗原簇結合相關自身抗體，繼而被吞噬破壞、凋亡，造血細胞數量急劇下降，長此以往，最終引起患者外周血中血細胞減少［4］。雖然有關于T細胞調節失衡引發B細胞增殖活化異常，最終導致自身相關性抗體產生是IRP的主要可能的發病機制，但是有關于IRP中T細胞的增殖活化調控機制目前仍不清楚，未見相關的報道。

CTLA-4/CD28-B7共刺激通路是T細胞活化的上游調控機制，是其活化過程中必不可少的刺激信號［5-6］，因此，通過研究CTLA-4/CD28 -B7共刺激通路對T細胞增殖分化的影響，能夠幫助我們對IRP發病機制有更進一步的了解。本實驗將共刺激分子CTLA-4、CD28、CD80及CD86作為研究目標，通過研究IRP患者骨髓造血細胞中CTLA-4、CD28、CD80及CD86四類共刺激分子的mRNA表達，來了解共刺激通路與IRP發病機制及其對T細胞調控間的關系。

本實驗證實IRP患者骨髓單個核細胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA存在異常表達，具體表現為CTLA-4mRNA表達明顯下降，CD28及CD80/CD86雖有下調但是較前者不明顯，CTLA-4在共刺激通路中占主導地位，CTLA-4mRNA表達下降可能導致T細胞增殖過度活化（尤其是TH2細胞），導致TH1/TH2比例倒置，TH1細胞功能受抑制，TH2細胞功能亢進，分泌大量正性刺激因子促進B細胞活化增殖，抑制B細胞凋亡，可能導致CD5+B1群細胞過度活化，而CD5+B1群細胞與產生自身抗體有關，最終導致骨髓造血細胞產生自身抗體，引起外周血細胞減少。作者從 CTLA-4/CD28/B7共刺激通路角度，為臨床進一步了解 IRP 發病機制提供了新的思路和方向。