CLDN10基因檢測在甲狀腺癌診療的相關性研究及應用

俞科 黃婷 劉異 俞俊鋒 吳曉芳

近年來我國甲狀腺癌的發病率逐漸升高，尤其是甲狀腺乳頭狀癌是近10年7種增長較快的惡性腫瘤之一。美國甲狀腺學會推薦，甲狀腺細針穿刺活檢術（FNAB）是目前鑒別良惡性結節的金標準。CLDN10是高遷移率族蛋白家族中的一員，是小分子非組蛋白染色體蛋白，有CLDN10基因編碼，CLDN10蛋白在胚胎發育過程中高表達，而在已經發育成熟的組織或分化組織中低表達或無法檢測，CLDN蛋白自身無轉錄活性，作為轉錄調控蛋白，通過結合DNA和修飾染色質構型來影響細胞功能活性［1］。越來越多證據證實CLDN10與癌癥發生發展相關。CLDN10可能通過靶向調節一些細胞周期相關的基因促進腫瘤細胞增殖。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年7月至2018年5月期間隨機收集杭州市余杭區中醫院50例甲狀腺結節患者、50例甲狀腺癌與50例健康人，年齡32～71歲，男83例，其中健康人25例，甲狀腺良性腫瘤患者24例，甲狀腺癌患者23例；女67例，其中健康人25例，甲狀腺良性腫瘤患者26例，甲狀腺癌患者16例。健康人群從體檢人群中告知抽選，本研究獲得了本院倫理委員會批準。

1.2 RNA提取步驟 （1）取米粒大小的組織，液氮研磨；（2）將研磨好的組織粉末加到1ml的trizol中，用移液槍上下吹吸數次；（3）加200μl氯仿，渦旋混勻，4℃，13000r/min離心15min；（4）緩慢取出，用移液槍小心吸取上清液于另一新的EP管中，注意不要吸到中間層；（5）吸出來的上清液中加入等體積的異丙醇，緩慢上下顛倒混勻，然后放至-20℃冰箱中30min；（6）取出后，4℃，13000r/min離心10min；（7）去掉上清液，加入75%乙醇洗滌，4℃，13000r/min離心10min；（8）離心后去掉上清液，室溫下干燥5～10min，加入30～50μl RNase freeH2O，測濃度，于-80℃保存。

1.3 cDNA合成（逆轉錄反應） （1）配置逆轉錄反應液試劑為TOYOBO公司的Rever Tre Ace qPCR RT Kit試劑盒。第一步：試劑1；反應程序：反轉錄條件：65℃，5min；冰浴 2min。第二步：試劑2；反應程序：反轉錄條件：37℃，50min；98℃，5min；反應完成后，放4℃備用。（2）SYBR QPCR：儀器：PCR儀 ABI 7500；試劑：TaKaRa SYBRR Premix Ex Taq TM Ⅱ（Perfect Real Time）DRR081， 取2μl DNA加 至23μlReal Time PCR 反應體系中，總共25μl體系，反應條件：93℃3min，93℃30s；55℃45s；72℃45s 40循環，收集溶解曲線。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0軟件分析。計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 采用ELISA法檢測CLDN10蛋白在不同甲狀腺組織中的表達結果癌癥組、良性結節組、正常組均采用 ELISA法檢測CLDN10蛋白在不同甲狀腺組織中表達結果，CLDN10蛋白陽性率（n）在三組中分別為癌癥組40，良性結節組為0.06，正常組為0.04。三組中癌癥組陽性率最高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 甲狀腺癌組織中CLDN10基因mRNA轉錄及其蛋白表達相關性分析 見表1。

表1 甲狀腺癌組織中CLDN10基因mRNA轉錄及其蛋白表達相關性

2.3 甲狀腺癌組織中CLDN10基因表達與臨床相關性分析 見表2。

表2 甲狀腺癌組織中CLDN10基因表達與臨床相關性分析（n）

2.4 甲狀腺癌患者單因素及多因素生存分析 見表3。

表3 甲狀腺癌患者單因素及多因素生存分析

3 討論

高遷移率蛋白（CLDN）A2蛋白是一種非組蛋白染色體蛋白，其能通過與染色質結合而改變染色質的結構，或直接與相關蛋白發生作用，繼而調節其他基因的轉錄，進而影響腫瘤等發生。CLDN10在大多數腫瘤中均有高度表達，如甲狀腺癌、結腸癌［2］、肺癌［3］和胃癌［4］等，而在正常組織中均不表達。本研究探討CLDN10基因的表達水平與甲狀腺結節和甲狀腺癌的發生、發展的關聯性，對甲狀腺結節和甲狀腺癌的診斷、預防和臨床治療提供幫助。

本研究采用ELISA法及real time-PCR檢測對甲狀腺癌患者、甲狀腺良性結節患者以及健康人的CLDN10基因進行采集并進行分析，得出甲狀腺癌患者的CLDN10表達陽性率明顯高于甲狀腺良性結節和健康人兩組，提示CLDN10基因在甲狀腺癌中高度表達。CLDN10目前已被公認為是一種新的癌基因，認為其在腫瘤的發生、發展中的作用可能與參與調節腫瘤相關基因的轉錄以及破壞DNA修復系統等相關［5］。Olson等［6］表明CLDN10可能通過pRB途徑直接活化E2F1的活性，從而促進腫瘤細胞異常增殖。

本研究對甲狀腺乳頭狀癌患者預后進行單因素生存分析發現CLDN10、腫瘤大小、淋巴結轉移、是否侵犯腺體是其危險因素，進一步多因素生存分析發現CLDN10、淋巴結轉移、是否侵犯腺體是其獨立預測因素，而腫瘤大小不再是其獨立預測因素，提示CLDN10基因可促進甲狀腺腫瘤的發展及淋巴結轉移，可能因為CLDN10基因還通過靶向調節一些相關的基因從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移［7］。蔡菁［8］認為CLDN10蛋白表達水平較高常預示有遠處轉移或患者的生存時間較短。研究還發現CLDN10能夠促進上皮細胞間質化（EMT），從而導致甲狀腺腫瘤的侵襲和轉移能力增強［9］。CLDN10還可以作為甲狀腺癌患者預后判斷的指標。Belge等［10］研究提示CLDN10檢測在鑒別良、惡性甲狀腺腫瘤方面的敏感度和特異度分別為95.9%和93.9%，這對于甲狀腺腫瘤切除術中的冷凍切片病理學檢查具有重要意義。

本研究發現CLDN10在甲狀腺乳頭狀癌患者中顯著表達，同時與腫瘤轉移及腺體侵犯與否有關，是判斷甲狀腺癌患者預后的獨立預測因子，對臨床治療指導及預后判斷具有重要意義。