尼可地爾對兔實驗性空氣肺栓塞動脈高壓的作用研究

王海鵬 屈百鳴 張健

肺 動 脈 高 壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）由世界衛生組織（WHO）劃分為原發性肺動脈高壓和繼發性肺動脈高壓，其中繼發性肺動脈高壓發病率較高，是由多種疾病逐漸發展出現肺血管阻力，右心負荷升高最終導致右心功能衰竭的一組臨床病理綜合征［1］。繼發性肺動脈高壓相關的治療仍是目前醫學難點，現多項臨床研究已經證實KATP通道參與了血管收縮和重構的病理過程，對舒張肺血管效果明顯［2］。缺氧狀態時KATP通道開放劑能夠顯著提高肺動脈平滑肌細胞上鉀離子通道的活性，對舒張肺血管效果較為明顯［3］。本實驗研究應用的尼可地爾屬于煙酰胺類KATP通道開放劑，化學名硝酸乙氧煙酰胺，其作用機制主要可歸納為使血管平滑肌松弛和血管舒張［4］、改善肺動脈血管的重構。作者自2013年1月至2014年12月通過動物實驗探究尼可地爾對肺動脈高壓的療效，將肺動脈壓力測定、超聲評估等方面作為研究重點。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級新西蘭大白兔50只，體重1.6～2.0kg，雌雄不限，兔齡5～6個月，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。RM6240系列多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠），全功能心電監護儀（spacelabs德國西門子公司），有創動脈血壓壓力換能器（深圳市新世聯科技有限公司），動靜脈留置針（24G*0.75IN，蘇州碧迪醫療器械公司），20%氨基甲酸乙酯注射液（烏拉坦）（西安醫科大學藥廠生產），尼可地爾片 5mg×100（日本 Tohoku Nipro Pharmaceutical Corporation），光學顯微鏡（浙江中醫藥大學病理實驗室提供）。采用計算機隨機數發生器將動物隨機分為3組，分別為普通對照組15只、肺動脈高壓模型組20只和尼可地爾藥物組15只，稱重并記錄。

1.2 實驗方法 （1）兔實驗性肺動脈高壓模型的制作：實驗兔分別固定于活動式立式兔實驗固定臺上，1ml注射器經耳緣靜脈建立靜脈通道，實驗每日同一時段重復注射，連續28d。①普通對照組：經耳緣靜脈緩慢注射生理鹽水，劑量為0.3ml/（kg·10min），注射完畢后觀察15min，確認生命體征平穩后放回兔籠。②肺動脈高壓模型組：經耳緣靜脈緩慢注射空氣團，劑量為0.3ml/（kg·10min），注射完畢后觀察15min，確認生命體征平穩后放回兔籠。③尼可地爾藥物干預組：操作同肺動脈高壓組實驗兔。此外，尼可地爾片溶解于生理鹽水后灌胃，劑量為1.15mg/kg，灌胃3次/d，重復28d，灌胃完畢后觀察15min/次，確認生命體征平穩后放回兔籠。（2）肺動脈內徑及Tei指數的超聲分析：實驗方法：將實驗兔水合氯醛（2.5ml/kg）灌腸鎮靜，左側仰臥位四肢固定于木板上，使木板向左傾斜30°，8%硫化鈉溶液均勻涂抹于胸前區，剃凈胸毛，使用GE公司Vivid 7 Dimension超聲心動圖儀，M3S探頭，頻率1.5～3.5MHz。超聲探頭置于兔胸骨左側進行測量，獲取心底短軸及心尖四腔切面，測定肺動脈內徑（如圖1）。啟用定量組織速度成像模式，取樣點置于右室游離壁三尖瓣環位置，以TDI的速度脈沖方式顯示三尖瓣環運動頻譜 ：收縮期s波、舒張早期e波，舒張晚期a波（如圖2），測量右室等容收縮時間（ICT）、等容舒張時間（IRT）及射血時間（ET），計算右室Tei指數（如圖3）。選擇清晰的圖像保存待以后分析，每只取3個心動周期平均值［5］。Tei=（ICT+IRT）/ET；A：a波終末至下一心動周期e波起始的間期=（A-B）/B；B：a波終末至下一心動周期s波的終止間期（3）兔實驗性肺動脈高壓模型建立及尼可地爾干預組、正常對照組的肺動脈壓力測量：①實驗動物準備：兔固定于兔實驗臺上，經耳緣靜脈予靜脈留置針建立靜脈通道，肝素封管。用20%烏拉坦溶液經耳緣靜脈緩慢注射麻醉，麻醉劑量為5ml/kg。用8%硫化鈉溶液分別于近軀干右上肢、左上肢、右下肢及左下肢皮膚上（各部位面積約3cm×5cm）進行脫毛，胸骨處（面積約5cm×5cm）進行脫毛。切開氣管并插入氣管導管以備接呼吸機用。準備壓力換能器再連接到多通道生理儀，連接ECG，以監測心率，心律。②肺動脈壓力測定：實驗兔胸骨柄左緣第二肋開始切開約2cm手術切口，依次為皮膚、皮下筋膜、肌肉、肋骨。以120mm小三爪自動牽開器緩慢擴張胸骨切口。暴露切口，不打開心包，彎鉗緩慢剝離甲狀腺，即可定位肺動脈主干，動脈穿刺針穿刺肺動脈并置管，固定后接壓力換能器再連接到多通道生理儀，監護儀上可見肺動脈壓力波形（如圖3），穩定1～2min后，分別記錄肺動脈的收縮壓、舒張壓和平均壓。③實驗觀察與記錄：多道電生理儀記錄實驗兔肺動脈壓力，應用RM6240系列多道生理信號采集處理系統軟件處理并分析實驗動物肺動脈壓力，以區域測量方法測得肺動脈壓力舒張壓、收縮壓、脈壓差、平均壓。

圖1 超聲心動圖測量肺動脈內徑

圖2 多普勒超聲心動圖測量

圖3 肺動脈壓力波形圖

1.3 統計學分析 采用 SPSS18.0 統計軟件。計量資料以（x±s）表示，三組間Tei值比較采用單因素方差分析，肺動脈內徑比較采用t檢驗，肺動脈壓力比較進行兩個獨立樣本Mann-Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 超聲心動圖評價 超聲測量的各組肺動脈內徑值比較見表1。各組ICT、IRT、ET及Tei指數比較見表2。

表1 各組肺動脈內徑值比較（x±s）

表2 各組ICT、IRT、ET及Tei指數比較（x±s）

2.2 三組肺動脈壓力測定比較 見表3。

表3 三組肺動脈壓力測定比較［mmHg，（x±s）］

3 討論

目前肺動脈高壓的制作模型多應用低氧環境下飼養［6］、野百合堿藥物注射［7］、高血流量外科手術［5］等方法制作，其中應用最為廣泛的是缺氧艙下制作的低氧性肺動脈高壓大鼠模型。本實驗創新性的選擇使用“空氣肺栓塞”的方法建立肺動脈高壓的兔實驗模型。最后測得13只實驗兔的平均壓力為（38.763±7.000）mmHg，相對于正常對照組實驗兔測得肺動脈平均壓（22.413±0.913）mmHg明顯升高約16mmHg，符合肺動脈高壓的肺動脈壓力診斷標準，且通過超聲評價所得出的結果一致性較強，可得知本實驗中這種新型的“空氣栓塞”法建立肺動脈高壓模型的方法是成功且為可復制的，為肺動脈高壓治療的研究提供了一種新型的動物模型建立方法。“空氣栓塞”的方法建立肺動脈高壓的動物模型具體生理機制為：空氣在血管中形成小的氣泡通過右心房進入右心室，在右心室被擊碎成極小的氣泡進入肺動脈，在細小的肺動脈中形成栓塞，從而造成了實驗動物的缺氧狀況，持續一段時間后融入血液，缺氧情況逐漸緩解。而連續28d的重復性操作，則會引起肺血管的收縮和重構。

新型的“空氣栓塞”肺動脈高壓動物模型較傳統的肺動脈高壓動物模型的優點主要包括：（1）簡單經濟：此模型制作方法簡單，僅需在耳緣靜脈建立靜脈通道后用空氣團注射即可；且所使用的實驗設備較少，僅需實驗兔固定臺、一次性注射器和留置針。（2）可復制性強：本實驗對實驗動物的飼養條件要求較低，且無需建立專門的低氧艙，可以大批量的復制動物模型。（3）使用動物更廣泛：本實驗可在兔上成功建立模型，為肺動脈高壓的動物模型家族增添新的成員。（4）更接近臨床：注射野百合堿作為最為經典的肺動脈高壓模型建立方法被廣泛應用，但其主要是野百合堿通過炎癥反應損傷肺動脈內皮，誘導肺動脈血管重建來建立的接近結締組織相關肺動脈高壓發病機制的動物模型。與臨床上常見的低氧性肺動脈高壓的發病機制有一定的差異［8］。

當然，任何新的事物的出現都是一個從基本逐漸走向完美的過程，本實驗中創新性的建立空氣栓塞肺動脈高壓實驗兔模型優點突出，而在具體的操作過程中遇到的困難也不可忽略。在實驗過程中主要的困難包括：（1）操作要求嚴格：因為每個動物的體質差異，在實驗過程中，空氣團注射是較為困難的操作，既要求注射速度適中，也需在動物出現不能耐受的情況下及時停止操作，避免動物的死亡。（2）感染情況：兔肺部嬌嫩，極易出現肺部感染，而空氣的注入則會加大肺部的感染率，且在模型建立后期，因肺動脈高壓導致的右心功能減退，也會出現肺瘀血等癥狀，從而出現肺部感染。在實際操作過程中，有近1/10的實驗兔因肺部感染嚴重而不能作為模型參與實驗。（3）病死率：空氣注射對注射方法、時間及速度要求嚴格，否則會出現實驗動物的死亡，在具體的實驗過程中確實出現猝死現象。

目前超聲心動圖作為一項無創檢查技術為肺動脈高壓的診斷提供了非常重要的依據，與右心導管檢查有較好的相關性，其診斷價值已得到廣泛認可。超聲心動圖既可以對肺動脈高壓原發病能做出診斷，也能估測右心房壓力、肺動脈的收縮壓和舒張壓。

在肺動脈壓力測定的操作過程中主要出現的問題有：隨著心臟的搏動，肺動脈導管測得的壓力曲線也會出現相應的波動，這對肺動脈壓力測定后的統計造成了一定的難度。在插入動脈留置針時需使用彎鑷輕夾肺動脈壁，是否會造成肺動脈交感興奮收縮從而導致壓力增高及開胸對肺動脈壓的影響仍有待進一步的論證。

本次試驗的對象是新西蘭大白兔，在物種上、實驗動物的數量，以及實驗模型同臨床實際疾病的發生還是存在一定差異，但實驗結果顯示了尼可地爾在抗兔肺動脈高壓方面發揮了積極作用，為進一步的研究打下基礎。