外周血Treg細胞亞群及其細胞因子與心肺功能在COPD穩定期患者中的相關性研究

陳瑋 郝建 蔡秋萍 錢鈞 吳海燕 侯曉麗

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive PulmonaryDisease，COPD）由環境中明顯的暴露因子所引起氣道和/或肺泡異常所致肺泡功能單位的結構破壞［1］，其作為一種可預防可治療的臨床常見疾病之一，以氣流受限為特征。在COPD的發生發展中，呼吸道持續存在的慢性炎癥，與其心肺運動功能的減退有密切聯系［2］，CD4+T細胞介導的免疫學機制同樣發揮著重要的作用［3］。CD4+T細胞在不同的細胞微環境中，可以分化為Treg和Th17細胞亞群，Th17可通過分泌IL-6、IL-7、IL-17、IL-21、IL-22等炎性細胞因子來募集巨噬細胞和中性粒細胞，促使炎性因子的釋放并加劇炎癥反應［4-6］。Treg細胞通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子對疾病的炎癥反應起到抑制的作用［7-8］，減輕自身的免疫應答和降低氧化反應所致的損傷。本課題希望通過研究Treg細胞亞群、細胞因子IL-17和TGF-β與心肺功能和肺功能之間的相關性來探討慢性炎癥對COPD患者臨床癥狀及運動耐量降低的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取在2016年1月至2017年12月期間中國人民解放軍杭州128醫院COPD穩定期患者30例設為觀察組，體檢中心健康人員30例設為正常組。兩組性別、年齡、體重、身高差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。入選標準：（1）符合中華醫學會2016年COPD診斷和分組標準；（2）病情嚴重程度：選取中重度的COPD緩解期患者且不伴有肺動脈高壓；（3）曾使用有創或無創機械通氣治療；（4）無嚴重心、肝、腎及其他影響鍛煉的局部或全身性疾病；（5）排除急性發作者；本項目必須經過醫院醫學倫理委員會批準，同時取得患者及其家屬的知情同意，并簽署同意書。

表1 兩組一般臨床資料比較（x±s）

1.2 實驗方法及測定 （1）流式細胞學測定：研究對象分別通過流式細胞計數測定血清中的Treg亞群細胞比例，研究方法和測定過程如下。①準備細胞：分別抽取患者空腹狀態下的肘靜脈血6ml，均分3ml分別置于已備制的200μl抗凝血（肝素）的2只試管內，然后，加入2ml 1X Lysing solution（10X加水稀釋）破膜10min后，作離心處理，以200r/min離心5min，隨后加入2ml staining buffer（PBS-BSA）重懸細胞固定5min，以相同轉速再次離心5min，吸取上清液，加入150μl staining buffer重懸細胞備用。②表面抗體染色：取100μl細胞懸液，加入相應的表面抗體染色，保存于4℃保存箱中30min，結束后加入2ml staining bufler后以200 r/min離心5min。③固定及胞內染色：在備用細胞懸液管中，加入1ml 1X Fix/Perm buffer，4℃放置50min，加入1ml 1X Perm/wash bufler，350r/min，4℃離心5min，再次加入2ml 1X Perm/wash bufler，重懸細胞，350r/min，4℃離心5min，每管加入100μl 1X Perm/wash bufler重懸細胞，加入FOXP3和IL17A胞內，混勻細胞，之后加入2ml IX Perm/wash bufler，350r/min，4℃離心5min，棄上清液，重復操作，加入350μl staining buffer重懸細胞后上機檢測，以上操作實驗均在浙江中醫藥大學臨床基礎研究所流式細胞室內完成。（2）細胞因子測定：研究對象使用ELISA方法檢測相關細胞因子表達情況，具體實驗方法及測定如下。抽取患者肘靜脈血中的上清液200μl至離心管中。在20℃下，以200r/min速度離心4min。隨后通過ELISA法檢測各組實驗血清中的細胞因子的濃度，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作，實驗地點位于浙江中醫藥大學臨床基礎研究所。上述測量指標主要試劑及儀器：流式細胞檢測過程中所使用的試劑購自上海優寧維生物科技股份有限公司；Human IL-17 ELISA KIT、Human TGF-β ELISA KIT等購自杭州達真生物技術有限公司；Bio-Tek ELX800全自動酶標儀，DGG-9240A型電熱恒溫箱，微量移液器（京君龍實驗儀器北京有限公司）；臺式冷凍離心機centrifuge 5804R（Univer，德國）；4℃保存箱（Panasonic，日本）。（3）肺功能指標：凡入選對象均采用肺功能儀（CHEST AC-8800，日本）監測正常組及觀察組用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV1/FVC）等指標，以上指標的測量在杭州128醫院心肺康復科實驗室完成。（4）心肺功能運動試驗（CPET）指標：采用心肺運動儀（Cosmed 2900型，意大利）監測正常組及觀察組峰值公斤攝氧量（Peak VO2/kg）、峰值功率（Peak Power）、CO2排出量（Peak VCO2）等指標。運動方式：為踩功率車；運動內容：開始時，在10W功率的情況下運動10min，再通過取無氧閾時功率的70%，作為運動負荷完成運動，以上指標的測量在杭州128醫院心肺康復科實驗室完成。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗比較各組間的均數差異，計數資料數據采用χ2檢驗，各組間數據的相關關系使用pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Treg亞群細胞比例及外周血中細胞因子的變化情況 觀察組患者外周血中的Treg亞群細胞比例較正常組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。觀察組患者外周血中的細胞因子IL-17及TGFβ表達水平較對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 兩組外周血Treg亞群細胞比例、細胞因子變化情況（x±s）

2.2 心肺運動功能及肺功能變化情況 觀察組患者的Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2較正常組下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。觀察組患者的FVC和FEV1/FVC較正常組下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表3）。

表3 兩組心肺運動功能及肺功能變化情況比較（x±s）

2.3 Treg亞群細胞及血中細胞因子與心肺運動功能的相關性 觀察組患者Peak VO2/kg、Peak Power、Peak VCO2與Treg細胞亞群比例呈正相關（P＜0.05），上述指標與IL-17及TGF-β表達水平呈負相關（P＜0.05）（見表4）。

表4 觀察組外周血炎性因子水平與心肺運動功能的相關性（x±s）

3 討論

在多種疾病的發展過程中，Th17和Treg細胞亞群比例失調起到重要的作用，例如急性冠脈綜合征（ACS）［9］、類風濕關節炎（RA）［10］和銀屑病［11］等。在特定的微環境中，受不同受體特異性調控，在IL-6、TGF-β的誘導下CD4+細胞趨向分化為Th17細胞亞群；而在TGF-β的刺激下，趨向分化為Treg細胞亞群。Pack等［12］新發現，Th17作為Th細胞亞群的一種，其介導的自身免疫應答與Treg亞群所具有的免疫抑制作用，在功能上相互拮抗，在正常機體內維持動態平衡，并對炎癥反應的發生和維持免疫耐受起到重要的作用。許多研究表明，Th17/Treg的失衡在免疫性疾病中發揮重要的作用。

研究已表明，慢性炎癥反應是COPD不斷進展的重要原因［13］，巨噬細胞在其外周的氣道、肺實質和肺部血管中增加，同時活化后的中性粒細胞和相關淋巴細胞可以增加炎癥因子的釋放，增加氣道的高反應性，使得氣道重塑，導致肺功能的進一步損傷［14］。

多項研究表明，COPD穩定期患者外周血中的Treg細胞亞群比例明顯降低，而細胞因子IL-17及TGF-β表達水平升高［15］，提示穩定期的COPD患者，其免疫平衡狀態受到破壞，介導炎癥作用的細胞因子表達加強，而抗炎作用減弱。本實驗中，觀察組Treg細胞亞群比例較正常組明顯降低，IL-17及TGF-β表達水平較正常組升高，此況與文獻報道情況相似，提示COPD患者炎性細胞因子顯著上升，抑制性炎癥因子下降，機體的免疫平衡遭到破壞，機體對抗炎性物質的能力下降。雖然由Treg細胞亞群分泌的TGF-β作為一種抑制性炎癥因子，調控抑制淋巴細胞增殖，但其同樣也可誘導炎性細胞趨化，成為炎癥反應發生的媒介，在COPD患者中出現升高的趨勢。本組實驗研究提示，通過CPET所測得的Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2，均顯著性低于正常組；同時肺功能所測得的FVC和FEV1/FVC也顯著性低于正常組，提示隨著患者免疫平衡破壞，機體持續維持應激狀態，致肺功能的損害進一步的發生，使其心肺功能儲備及運動耐量下降，生活質量逐步下降。CPET指標Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2與Treg細胞亞群水平呈正相關，而與血清IL-17、TGF-β成負相關，提示COPD患者的心肺功能降低程度與機體內的炎癥反應呈正相關，隨著慢性炎癥反應持續發生，其心肺功能逐漸降低，使得COPD患者氣流受限加重，呼吸道癥狀反復發作。

綜上所述，在COPD患者氣道慢性炎癥的發展過程中，Treg細胞亞群及其相關細胞因子比例的失調起到重要的作用，可以發現Treg細胞亞群比例及其細胞因子對COPD穩定期患者臨床癥狀、健康狀態及運動耐量均有顯著的相關性。在今后的研究中，注重觀察對Th17/Treg細胞亞群比值與CPET對其他呼吸系統疾病的影響，進一步探討慢性炎癥反應對呼吸系統氣道高反應性的作用機制。