Leber遺傳性視神經病相關的三種原發性線粒體突變的無創檢測方法建立

王敏，呂媛媛，薛凌，鄭斌嬌，管敏鑫

（溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035）

Leber遺傳性視神經病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種主要累及青年男性，導致雙眼快速無痛性視力減退的母系遺傳性眼病。1871年首次出現對該病癥狀及遺傳特性的報 道[1-2]。線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）突變是該病的分子致病基礎之一[3-4]。m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變位點是最主要的引起LHON發病的原發位點[3，5-9]。在歐洲人群中，由這3個原發突變位點引起的LHON患者占90%～95%，而在中國人群中3 個突變位點只占約50%[10-11]。LIANG等[11]對1 218例中國漢族LHON家系統計分析，發現m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變分別占總人數36.12%、4.84%和1.48%，與JIA等[12]對903例中國LHON人群3個原發性突變位點的檢測基本一致（分別為34.6%、3.3%和0.4%）。因此，篩查LHON患者線粒體基因組中是否存在3個原發突變，成為LHON的重要診斷標準[13]。眾所周知，血液樣本是基因組DNA的極佳來源，然而在流行病學調查中，需要采集大量樣本，抽取血液樣本很困難且是侵入性的，所以常需要替代來源。根據之前的報道，從口腔黏膜細胞分離的DNA已成功用于基因檢測分析[14-16]。在本研究中，使用口腔拭子收集口腔黏膜細胞來提取DNA，該研究分2個階段進行。第一階段，將口腔黏膜細胞樣本與血液樣本提取的DNA從DNA濃度、純度和完整性各方面進行比較。第二階段，進行了基于PCR的焦磷酸測序、斑點雜交和Southern blot分析，以評估使用口腔黏膜細胞DNA檢測m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變的可行性。

1 對象和方法

1.1 對象 在溫州醫科大學附屬眼視光醫院就診的3例基因檢測確定為m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突變的LHON患者和2個無血緣關系且身體健康的對照樣本（C049、C003）。根據《赫爾辛基宣言》原則，患者在參加本研究之前認真閱讀并簽署知情同意書，本研究經溫州醫科大學倫理委員會批準。對受檢者進行血液樣本和口腔黏膜細胞樣本的采集。受檢者必須在采集樣本前1 h內避免吸煙、飲酒或進食，以減少食物顆粒或其他外源物質影響樣品的可能性[12]。所有參與者在樣本收集前需用自來水漱口10 s，然后用棉簽刮左側臉頰內部上下牙床處黏膜，用刷牙的力度上下擦動，同時旋轉拭子，讓拭子頭部充分接觸口腔黏膜，重復此動作上下刮拭10次，最后用同樣的方法刮右側口腔黏膜，采集口腔拭子3根。將棉簽風干30～60 min并置于密封的干燥劑塑料袋中。同時，受檢者自愿提供2 mL外周血，血液樣本儲存在抗凝管中。然后將口腔黏膜細胞樣本和血液樣本立即送到實驗室，并在4 ℃下儲存以防止DNA降解。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量：①手工法：使用無菌鑷子將風干棉簽表面上的棉花撕脫，并轉移到含有600 μL 細胞裂解緩沖液和3 μL蛋白酶K的2 mL無菌離心管中。將混合物在55 ℃裂解12 h。孵育完成后，向混合物中加入600 μL預冷的乙酸鉀，并將混合物在冰上靜置10 min。然后將混合物離心：4 ℃、 12 000 r/min、10 min。將上清液轉移到1.5 mL無菌離心管中，并加入600 μL預冷的異丙醇。混勻后，將混合物在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。棄上清液，用600 μL無水乙醇將沉淀物重懸，并在室溫下以12 000 r/min離心3 min。棄上清液。65 ℃、40 min干燥DNA后，向離心管中加入50 μL ddH2O溶解DNA。用分光光度法測DNA在260 nm和280 nm處的吸光度值來測定全基因組DNA的濃度和純度。②試劑盒法：根據口腔拭子的規格，使用QIA amp DNA Mini Kit（50）按照說明書提取口腔黏膜細胞DNA。根據HiPure Tissue DNA Mini Kits說明書來提取血液DNA。通過分光光度法測DNA在260 nm和280 nm處的吸光度值來測定全基因組DNA的濃度和純度。通過將DNA濃度與DNA樣品的最終體積相乘來計算DNA產量。

1.2.2 m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A 突變檢測：針對存在m.11778G＞A、m.14484T＞C 和m.3460G＞A突變的鑒定詳見文獻[17]。使用特異性寡核苷酸引物對突變者的包含突變位點的DNA片段進行PCR擴增，即擴增含m.G11778A突變的11 654～11 865片段、含m.T14484C突變的14 260～14 510片段、含m.G3460A突變的3 108～3 717片段[18]。具體來講，為了檢測m.T14484C突變，以全基因組DNA為模板，用mtDNA 14 000～14 998位置對應的PCR特異性引物來擴增得到第1段PCR產物，以排除可能的核假基因的共擴增[19]。然后，以第1 段PCR產物作為模板，用m.DNA 14 260～14 510位置的特異性引物來擴增得到第2段PCR產物（251 bp）。然后取1 μL提取的DNA，PCR反應總體系為25 μL，包含2 pmol/L相應的特異性引物、 5 mol/L dNTP、37.5 pmol/L MgCl2、2 μL 10× ExTaqbuffer（不含Mg2+）、0.5 U Taq DNA聚合酶和 18 μL ddH2O。PCR反應程序為預變性94 ℃ 3 min、變性94 ℃ 30 s、退火56 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 30 s、35 個循環，最終延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。5 μL擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確定特異性的擴增條帶后，將10 μL擴增產物送上海六合華大基因科技公司測序，測序結果使用CodonCode Aligner軟件與經過校正的劍橋標準序列（GenBank輸入編號：NC_001807）進行比對，發現突變位點后用Chromas 2.0軟件讀取測序結果的峰圖文件，進行確認或排除。

1.2.3 斑點雜交：將25 ng PCR產物直接加載到帶正電荷的尼龍膜（Roche）上，用寡脫氧核苷酸探針進行雜交分析。為了檢測MT-ND4 m.11778G＞A突變，使用特異性非放射性地高辛（digoxigenin，DIG）標 記的寡脫氧核苷酸探針：5’-ATGATGCGACTGTGAGTGC GT-3’；對于MT-ND6 T14484C突變，使用探針：5’-ATGA TGGTTGTCTTTGGAT-3’；對于MT-ND1 G3460A突變，使用探針：5’-GGCGTCAGCGAAGGGTTGTAG-3’。通過用DIG Oligo-nucleotide Tailing Kit（Roche）使寡脫氧核苷酸探針標記上DIG。將尼龍膜放在含有5 mL DIG Easy Hyb（Roche）雜交液的雜交瓶中，56 ℃雜交爐中雜交16 h。雜交后，洗膜程序為：尼龍膜在室溫下在2×SSC ＆ 0.1% SDS中洗滌2次，每次 5 min；然后在37 ℃，0.5×SSC ＆ 0.1% SDS中洗滌2次，每次15 min；用DIG Wash and Block buffer、 Anti-digoxigenin-AP、Fab fragments和CDP-Star（Ro-che）檢測DIG標記的探針[20-22]。

1.2.4 Southern blot：將50 ng PCR產物進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后，將凝膠上的PCR產物電轉印跡到帶正電的尼龍膜（Roche）上，55 ℃雜交探針過夜，第2天檢測探針，方法同上。

1.3 統計學處理方法 使用SPSS18.0進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DNA濃度和純度比較 手工法和試劑盒法從口腔黏膜細胞和血液樣本中提取的DNA濃度的差異無統計學意義（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜細胞DNA純度低于用試劑盒法提取的口腔黏膜細胞和血液樣本DNA的純度，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明了口腔黏膜細胞用2種方法提取的DNA產量與血液樣本相似，但是用試劑盒法提取的DNA的純度更高。見表1。

表1 不同樣本來源的DNA濃度和純度的比較（±s）

表1 不同樣本來源的DNA濃度和純度的比較（±s）

與試劑盒法比：aP ＜0.05

DNA來源 n DNA濃度（ng/μL） DNA純度（A260/A280） DNA總量（μg）口腔黏膜拭子 手工法 5 47.0±12.0 1.37±0.19a 2.35±0.60 試劑盒法 5 50.4± 9.9 1.70±0.08 2.52±0.49靜脈血 5 55.6± 7.3 1.81±0.01 2.78±0.37

2.2 來自口腔黏膜細胞和血液樣本鑒定m.G11778A、 m.T14484C和m.G3460A突變的比較 對口腔黏膜細胞和血液樣本DNA經PCR擴增，純化PCR產物后進行DNA測序分析。結果顯示口腔黏膜細胞樣本和血液樣本的測序結果一致，突變組均可以檢測到相應的點突變，而對照組DNA為野生型。2種樣本用測序方法檢測m.G11778A、m.T14484C和m.G3460A突變的結果一致，初步說明口腔黏膜細胞可以用于檢測這3個點突變。見圖1。

2.3 斑點雜交和Southern blot檢測口腔黏膜細胞和血液樣本突變的比較 采用斑點雜交和Southern blot分析檢測受檢者是否存在m.G11778A、m.T14484C 和m.G3460A突變。可以檢測到沒有這些突變位點的對照組樣本，而不能檢測到具有這些點突變的突變組樣本。此外，斑點雜交和Southern blot分析結果表明，從DNA1、DNA2和DNA3擴增的3種PCR產物的結果差異無統計學意義（P＞0.05）。進一步驗證了用患者的口腔黏膜細胞可以用于m.G11778A、m.T14484C和m.G3460A突變的檢測。見圖2。

圖1 3個突變組（WZ1345、WZ1481、WZ1478）和2個對照組（C049、C003）樣品的部分測序峰圖

圖2 斑點雜交和Southern blot檢測口腔黏膜細胞和血液樣本突變的比較

3 討論

LHON是一種遺傳性疾病，來自不同種族背景的80%～95%的LHON家系被診斷為具有3種主要的線粒體G11778A、T14484C和G3460A突變[10]。本研究表明，使用口腔拭子進行DNA收集用來檢測線粒體G11778A、T14484C和G3460A突變是可靠的。口腔拭子可提取足夠量的DNA，其純度足以進行PCR及后續的測序試驗等，并且與血液樣本一樣準確[23-24]。同時口腔拭子收集是無創的，可以很容易地在家里進行[25-26]。對于所有研究對象，從口腔黏膜細胞和血細胞中提取的DNA確定的測序結果、斑點雜交結果和Southern blot結果是相同的。此外，口腔拭子可以在沒有醫療監督的情況下收集，也適用于嬰幼兒，并且結果不受室溫條件的影響[26]。這提供了在沒有靜脈采血條件的家庭和中心收集的機會，因為口腔拭子可以通過標準郵件輕松地郵寄到基因檢測實驗室，這也降低了篩選高危人群中LHON基因的門檻。總之，通過簡單的口腔拭子技術收集的口腔黏膜細胞的DNA是血液細胞DNA的準確且實用的無創替代物，可用于LHON的3個主要點突變的檢測。

與從血液樣品中分離DNA相比，口腔拭子方法的局限性是較低的DNA量和質量。因此，對于獲得的材料用于臨床或研究目的大的其他LHON相關的突變的測量是有限的。另一個需要考慮的重要問題是在家中家庭成員之間交換口腔拭子的風險。最后，與從血細胞中分離DNA相比，從口腔拭子中分離DNA因為孵育時間更長，所以更耗時。然而，與靜脈穿刺消耗的成本相比，用口腔拭子收集DNA的勞動強度更低[27]。

綜上所述，本研究結果表明，使用口腔拭子從口腔黏膜細胞中收集DNA可提供數量足夠和質量良好的DNA，用于LHON相關的3種主要線粒體點突變的檢測。口腔拭子也可以用作自我管理的郵寄測試，使用這種方便的無創技術，更有利于弱勢群體（如兒童）的LHON相關的3種原發性線粒體突變的篩查。