利用流式分選技術富集空載質粒轉染特定巨噬細胞的方法及條件優化

吳昊，王敏，羅賢強，郭建春，鄭斌嬌，2

（溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.浙江省醫學遺傳學重點實驗室；2.Attardi線粒體生物醫學研究院）

現階段常用于細胞分離的方法主要有密度梯度離心法、磁珠分離法和流式細胞分選技術。密度梯度離心法操作簡單，但分選細胞效率低；磁珠分離法只能進行單因素分離，且會對細胞產生免疫刺激或機械損傷[1]。而流式細胞術不但能做到無菌分選，而且可多因素正選或負選，具有定量、高通量、分選純度高等特點。近年來流式細胞分選技術越來越廣泛地應用于目的細胞或粒子的快速分離，如外周血原代單核細胞、精子、蛋白聚合體、腫瘤細胞等[2-5]。閔智慧等[6]用不同的噴嘴分選Raji等細胞，發現使用不同的噴嘴對細胞的得率、活性有影響。黃瑩瑩等[7]使用流式分選技術分選CD8+T細胞，發現流式細胞技術分選法較免疫磁珠法效率更高，更能得到高活性細胞。VOROBJEV等[8]通過評估濾光片的性能對流式分選條件進行優化，用優化后的條件分選受寄生蟲感染的紅細胞，分選純度比只用普通標準濾光片提高了50%～150%。本研究以J774A.1細胞株為實驗對象，使用攜帶GFP報告基因的PX458空載質粒轉染J774A.1細胞，以GFP熒光強度、7-AAD進行雙因素分選，旨在建立富集PX458 空載轉染J774A.1細胞的最佳方案，確立用于篩選J774A.1細胞的最佳條件。

1 材料和方法

1.1 材料 BD FACSAria II流式細胞分選儀（美國BD公司）；多功能酶標儀（美國MD公司）；PX458購自北京普如汀生物技術有限公司；QuickShuttle-Su perfast購自北京博奧龍免疫技術有限公司；7-AAD Viability Staining Solution購自美國Biolegend公司；GFP（D5.1）XP?Rabbit mAb購自美國CST公 司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術公司；J774A.1細胞株購自ATCC。

1.2 方法

1.2.1 脂質體轉染：J774A.1細胞是來源于BALB/cN 小鼠網織細胞肉瘤的巨噬細胞株，通過脂質體轉染法將PX458空載質粒轉染J774A.1細胞株，加入10% FBS 1640培養基（不添加青霉素及鏈霉素），置于 37 ℃，5% CO2培養箱培養，1～2 d傳代1次。

1.2.2 Western blot鑒定：提取細胞蛋白，恒量上樣蛋白20 μg，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳。隨后，將蛋白質轉移到PVDF膜。膜用5%的脫脂奶粉封閉2 h，然后孵育相應的一抗[GFP（D5.1）XP?Rabbit mAb]和二抗[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）]。應用ECL顯色系統曝光，檢測蛋白信號。

1.2.3 細胞上機前處理及染色：用胰酶消化細胞，1 500 r/min，4 ℃離心5 min。使用10% 1640培養基重懸，計數5×106個細胞，懸浮于500 μL培養基。加入1 μL 7-AAD后，常溫避光孵育15 min。

1.2.4 流式細胞儀調試：BD FACSAria II流式細胞分選儀以BD FACSDiva Software為操作軟件，以1%無菌PBS為鞘液。開機后啟動液流，選擇合適的噴嘴及相應鞘液壓力，再打開主液流，調節液滴頻率、振幅。待主液流調節至適合且穩定的狀態，選中主液流框的“Sweet Spot”鍵，儀器會自動調節液滴頻率、振幅使液流穩定在設定狀態。打開側液流高壓，可見分選框內出現光斑。配制Accudrop微球，選中“Auto Delay”鍵，使儀器自動調節液滴延遲時間，側液流偏轉以99.5%以上為佳。更換分選模式只需在分選開始前，選中分選設置窗口，依次更換single cell、4-way purity、purity、yield、initial或fine tune模式即可。

1.2.5 流式細胞分選與分選效率檢測：準備J774A.1 陰性對照管、GFP陽性管、7-AAD單染管、樣本管4組細胞樣本。用陰性對照管設門，進行流式分析和分選參數調試。將樣本管細胞上機進行分選，將分選所得的細胞重新上機回測分析，測定其GFP陽性率。

1.2.6 細胞培養與凍存：分選所得的細胞以1 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清。用3 mL 10% FPS 1640細胞培養基重懸，轉至6 cm細胞培養皿培養。細胞生長狀態良好時，進行凍存，保存于液氮中。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，進行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養 原代J744A.1細胞培養鏡下觀察見圖1，細胞形態飽滿且貼壁牢固，提示細胞生長狀態良好。分選后所得細胞培養3 d后，熒光顯微鏡下觀察見圖2，細胞貼壁良好，GFP陽性率約90%，提示分選所得細胞可繼續培養且GFP持續表達良好。

2.2 GFP蛋白表達鑒定 將構建的PX458空載質粒轉染的J744A.1細胞用Western blot進行GFP蛋白表達的定性鑒定。如圖3所示，經PX458空載質粒轉染的J774A.1細胞已攜帶GFP報告基因，提示構建成功。

圖1 原代J774A.1細胞生長狀態圖

圖2 經PX458空載質粒轉染的J744A.1細胞培養3 d熒光鏡下圖（×100）

圖3 Western blot定性鑒定GFP蛋白表達結果

2.3 主液流調試 100 μm噴嘴的主液流Gap帶適合位置是液流框的上1/3處，以主液滴各滴形狀規則，小衛星點少于6個且融入液滴良好為佳（見圖4A）。若Gap帶的位置過低或過高都將引發衛星點及液滴分布異常，導致分選效率降低或無法進行分選（見圖4B-D）。

2.4 分選模式與分選純度 分選前，帶GFP的J774A.1細胞株（GFP陽性細胞）被分成6大組，每組3個樣本，經單因素方差分析，分選前各組GFP陽性率差異無統計學意義（P=0.85）。將各大組樣本分選后得到的GFP陽性細胞重新上機進行回測，得到回測GFP陽性率。經單因素方差分析，分選后各組GFP陽性率差異有統計學意義（P＜0.01）。由表中可知，分選回測陽性率最高的分選模式為purity模式，可達95.7%±1.0%。回測陽性率達90%以上的有single cell和fine tune模式，分別為91.0%±0.2%和92.0%±0.4%。見表1和圖5。

3 討論

流式分選技術是指在流式分析技術基礎上，快速準確判斷目標細胞所在的液滴并加以特定電荷，使目標細胞在電場中發生偏轉從而進行回收的一種現代細胞分選技術。分選后的細胞能直接用于培養、移植、核酸提取、單細胞PCR擴增或原位雜交等。

圖4 BD FACSAria II流式分選儀主液流調試

表1 不同分選模式下分選前后GFP陽性率（每組n=3，±s，%）

表1 不同分選模式下分選前后GFP陽性率（每組n=3，±s，%）

分選模式 分選前GFP陽性率 分選后回測GFP陽性率purity 4.0±1.8 95.7±1.0 single cell 3.9±1.4 91.0±0.2 4-way purity 4.1±1.6 86.4±1.1 yield 3.6±1.4 80.0±0.3 initial 5.1±0.2 82.7±1.5 fine tune 4.0±1.4 92.0±0.4 F 0.38 141.11 P 0.85 ＜0.01

流式細胞分選的關鍵在于參數的設定與調試。細胞分選的效率、純度直接受參數設定的影響，如果不能很好地掌握儀器的參數和條件設置技巧，將會對細胞分選的得率、純度和細胞活性產生較大影響[9]。如儀器的狀態（包括液流的穩定性、激光激發的程度、激光的穩定性），樣品的狀態（包括樣品的處理方式、樣品的濃度、樣品的質量）以及分選時使用的噴嘴孔徑大小，分選時選擇的分選模式（BD FACSAria II流式細胞分選儀可使用single cell、4-way purity、purity、yield、initial和fine tune 6種模式進行分選）等[10]。此外，細胞的流速，熒光蛋白的強度、熒光素的組合也會影響分選的結果[5]。

圖5 分選前GFP陽性率及不同分選模式分選后回測GFP陽性率

本研究的實驗對象J774A.1細胞是來源于BALB/cN 小鼠網織細胞肉瘤的巨噬細胞株，主要用于宿主對病原菌免疫應答的研究。PX458是一種攜帶GFP報告基因的空載質粒，將目的基因載入PX458質粒并轉染J774A.1細胞能夠構建含有GFP報告基因的BALB/cN小鼠巨噬細胞株，篩選之后用于后續功能研究。目標細胞的富集對后續的功能研究起著至關重要的作用。本研究使用BD FACSAria II流式細胞分選儀70 μm、85 μm和100 μm噴嘴對PX458空載轉染的J774A.1細胞進行分選。但選用70 μm和85 μm噴 嘴分選所得細胞細胞活力低下，無法存活。可能的原因是噴嘴孔徑太小，鞘液包裹的細胞經過噴嘴孔時受到擠壓，影響細胞的正常形態和生理功能，致使分選后培養時出現大批量死亡。選用100 μm噴 嘴分選后，細胞能夠正常存活并傳代。因此本實驗選用100 μm的噴嘴進行分選調試。噴嘴大小也會影響主液流窗口形狀，選定100 μm噴嘴后，通過調節振幅和頻率調節主液流形狀，以維持適合分選的液流。若液流調節不當，則會導致儀器無法正確抓取目標細胞，大大降低分選的純度。為確保主液流的穩定性和連續性，需把握以下3個方面：超聲清洗噴嘴避免噴嘴小孔堵塞；保證O圈的密封性，在安裝O圈時避免大幅上下移動；準確調整適當的振幅和頻率[11]。

劉錫娟等[12]通過優化流式分選相關參數，分選SMMC7721細胞，GFP陽性細胞群的分選純度達99.6%。SABATH等[13]用流式分選技術替代藥物篩選法分離Flp介導的GFP標記的重組細胞，結果顯示，分選后GFP陽性細胞的比例比未分選前提高了5～30 倍。在本研究中，6 種分選模式分選效率不同，所得的PX458空載質粒轉染的J774A.1細胞GFP陽性率從80.0%至95.7%不等，與J774A.1原代細胞相比，分選所得J774A.1細胞濃度提高了16～24倍。其中選用purity模式進行分選，分選效率最高，可達到95.7%。但該模式下雖分選純度高，卻會使得機器丟棄黏連的目標細胞而導致細胞得率的下降。而yield模式注重得率，因此會導致非目標細胞的誤選，分選所得細胞GFP陽性率相對較低，僅為80.0%。一般來說，細胞分選實驗以實驗目的為準，高富集實驗以目標細胞分選純度為指標。因此，本研究認為，當使用100 μm的噴嘴對J774A.1細胞株進行分選時，以purity模式進行分選較合適。

本研究調試優化相關參數后，分選所得細胞陽性率較未分選前提高了16～24 倍，分選純度可達95.7%，符合后續功能研究的要求。綜上，本研究通過流式分選技術，建立了富集PX458空載轉染的J774A.1細胞的新方法，可為流式細胞分選技術在其他細胞的分選應用上提供良好的參考。