新型IKKβ激酶抑制劑的體外抗胃癌活性

鮑苗，黃崇賢，胡俊，朱露，衛濤，陳肖鳴

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州325035）

我國是胃癌發病大國[1]。目前胃癌的主要治療手段為手術切除及化學藥物治療，常用的化療藥物為5-氟尿嘧啶、順鉑、多西紫杉醇等細胞毒類藥 物[2-4]。這類藥物最大的缺陷是不良反應嚴重，且易耐藥。靶向藥物因其高效低毒的特點，成為近年抗腫瘤藥物的研究熱點。然而胃癌的靶向藥物研究相對滯后，僅有針對HER2和VEGFR的藥物被批準用于臨床治療。

IκB激酶β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β，IKKβ）是細胞中核轉錄因子NFκB重要的調節酶，參與多種細胞生物途徑。研究表明，其高表達與胃癌等多種腫瘤的發生密切相關，抑制腫瘤細胞內的IKKβ可達到抗腫瘤效果[5-8]。小分子IKKβ激酶抑制劑是目前研究熱點，然而由于活性不強等原因，其抑制劑研究進展緩慢[8]。因此研發高效的IKKβ抑制劑具有非常重要的意義。

EF24為一種對多種腫瘤具有良好抗腫瘤活性的IKKβ抑制劑（IC50=72 μmol/L）[9]，但其激酶抑制活性有待提高。我們對本實驗室設計合成的EF24類似物進行了篩選，獲得了一個激酶抑制活性更好的類似物H18（見圖1），并研究了其體外抗胃癌活性。

圖1 H18的結構及發現

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌細胞BGC-823購于中國科學院上海細胞典藏庫，RMPI-1640培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%含EDTA胰酶購于美國Gibco公司，PBS緩沖液、雙抗購于美國Hyclone公司，MTT粉末購于北京索萊寶生物科技有限公司，抗人p-IKKα/β、IKKβ、IκBα、β-Actin抗體、抗兔二抗購于美國CST公司，TNF-α（T0157）和BMS345541（B9935）購于美國Sigma-Aldrich公司，CO2培養箱購于美國Thermo公司，DAPI染色液和結晶紫染色液購于上海碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白分子對接：下載人IKKβ蛋白晶體結構（PDB code：4KIK），與H18進行對接模擬。通過AutoDock模擬蛋白與分子對接形式，并進行可視化。

1.2.2 MTT實驗：取對數生長期細胞，以3 000個每孔的密度鋪在96孔板中，置于培養箱中過夜貼壁。第2天取出加藥。H18用DMSO溶解配成0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L共8個濃 度，每個濃度設置3個復孔，每孔加藥1 μL。同時設 置空白孔和DMSO孔。藥物孵育72 h后，每孔加入MTT 孵育4 h，棄去培養液，用150 μL DMSO溶解紫色晶體，搖床上振蕩10 min充分溶解，在酶標儀490 nm處測量吸光度。重復3次獲得數據，計算IC50。

1.2.3 集落克隆實驗：細胞每孔1 000個鋪6孔板，過夜貼壁后換液加藥。H18分別為5、10、20 μmol/L， 并用BMS345541作陽性對照。藥物孵育7 h后換成完全培養基繼續培養1周。用4%多聚甲醛固定15 min 后進行結晶紫染色，然后拍照。

1.2.4 DAPI染色：細胞每孔20萬鋪板，過夜貼壁后換液加藥。H18分別為5、10、20 μmol/L，并用BMS345541作陽性對照。藥物孵育時間48 h，然后用4%多聚甲醛固定后，避光加入DAPI染色液染色，在熒光拍照顯微鏡紫外光下拍照。

1.2.5 Western blot實驗：細胞30 萬每孔鋪板，先加H18分別為5、10、20 μmol/L，并用BMS345541作陽性對照，孵育2 h后，然后除空白孔以外，每孔加TNF-α，終濃度為1.5 ng/mL。TNF-α刺激10 min后，馬上冰上收蛋白。用考馬斯亮藍法定量配平后，加入loading buffer將蛋白樣品煮沸變性。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，再進行濕法轉膜。 4 ℃過夜孵育一抗后，室溫孵育二抗1 h，然后曝光。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，運用獨立樣本t檢驗進行2組比較，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H18與IKKβ的分子對接 通過分子對接初步探討化合物H18與IKKβ激酶的相互作用模式，對接結果見圖2，H18環戊酮上的羰基氧原子與殘基Leu307形成氫鍵相互作用；同時，H18能與IKKβ變構位點中的Leu123、Leu307、Leu311、Ile371和Leu376等氨基酸殘基形成疏水作用。氫鍵作用與疏水作用的疊加效果使得化合物與激酶緊密結合。

2.2 H18抑制BGC-823生長 利用MTT法對H18的抗胃癌活性進行檢測，結果發現H18以劑量依賴的方式抑制BGC-823細胞的生長，半數抑制濃度為（1.7± 0.3）μmol/L（見圖3）。

圖2 H18與IKKβ的分子對接

圖3 H18作用72 h的濃度-生存曲線

2.3 H18對BGC-823增殖和凋亡的影響 集落克隆實驗結果顯示，H18孵育7 h能明顯抑制BGC-823的克隆形成能力（見圖4A）。DAPI染色結果顯示，H18處理48 h，BGC-823細胞無明顯凋亡改變，而相同條件下陽性對照BMS345541的刺激已造成部分細胞發生凋亡（圖4B白色箭頭所示）。以上結果說明，H18主要通過抑制細胞增殖分裂從而產生抗胃癌細胞的作用。

2.4 H18對IKK-NF-κB信號通路的影響 Western blot實驗結果顯示，對比空白組，TNF-α 10 min刺激后成功誘導了IKK-NF-κB信號通路的激活；與TNF-α組相比，提前2 h預孵的藥物顯著抑制了TNF-α誘導的IKKβ的激活。盡管H18的抑制活性不如同等條件下的BMS345541，但也表現出了顯著的抑制活性（P＜0.05）；同時，H18可以劑量依賴性地抑制下游IκBα的降解，與BMS345541保持一致的效果（見圖5）。從另一方面也提示NF-κB復合物另一亞單位，P65解離后調節生物學進程可能受到了部分抑制。這說明，IKKβ抑制劑H18對IKK-NF-κB的抑制可能促成了其體外抗胃癌活性。

圖4 H18對BGC-823的增殖和凋亡的影響

3 討論

目前胃癌的靶向治療研究雖然很多[10]，但是臨床上已批準使用的僅有HER2抑制劑曲妥珠單抗、VEGFR抑制劑雷莫蘆單抗和阿帕替尼[11]。此外，報道的胃癌潛在靶點也很多，常見的如：PTEN[12]、mTOR[13]以及其他多種非編碼RNA[14-16]。

已有多項研究發現，抑制IKK可起到多種抗腫瘤作用：經典的IKK抑制劑BMS345541可在前列腺癌中抑制上皮間質轉化，并促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制前列腺癌轉移[17]。ANTONIA等[18]發現，在LKB1缺陷的腫瘤患者中，IKK抑制劑與苯乙雙胍可產生聯合抗腫瘤的作用。VREKA等[19]研究發現，高表達的IKKα可與KRAS共同誘導肺癌的發生，抑制IKKα可起到良好的抗肺癌活性。本研究發現，在胃癌細胞中抑制IKKβ的磷酸化激活，可起到體外抗胃癌的活性，這與先前的研究結果一致。

圖5 IKKβ抑制劑H18對IKK-NF-κB的抑制作用

EF24作為一個經典的姜黃素類似物，研究認為其具有抑制NF-κB信號通路的作用[20]。以EF24為先導化合物，設計合成EF24類似物可提高其對NF-κB的抑制活性：通過優化N取代獲得的化合物13 d，與EF24相比毒性下降，且對NF-κB的抑制活性得到提升[21]；以EF24和F35為共同先導化合物設計合成的5B，可通過激活JUK及抑制NF-κB信號通路產生抗肺癌作用，并在體外增敏順鉑及5-氟尿嘧啶的化療效果[22]；不對稱EF24類似物化合物81，通過抑制NF-κB信號通路產生抗肺癌作用[23]。本課題以EF24為先導化合物，將其結構進行改造，得到了新型化合物H18，使其對IKKβ的IC50從72 μmol/L降至 4.5 μmol/L，大大提高了其抑制活性，同時證明，新獲得的化合物H18通過抑制IKK-NF-κB信號通路產生體外抗胃癌效果。

綜上所述，我們的研究初步證明了IKKβ抑制劑H18的體外抗胃癌活性及機制，為IKKβ抑制劑的開發提供了新結構，為胃癌靶向治療提供了新的策略。