辣椒自然游離小孢子胚狀體誘導研究

高素燕 呂敬剛　焦荻　商紀鵬　焦定量　黃亞杰

摘? ? 要：為建立辣椒自然游離小孢子培養技術體系，以32個辣椒品種為試材，研究基因型（CL-1～CL-32）、基本培養基（MS、Nitsch and Nitsch、NLN、B5）、激素配比（ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 0.8 mg·L^-1、ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1、ZT 1.0 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1、ZT 1.5 mg·L^-1+IAA 1.5 mg·L^-1）、活性炭添加量（0.1，0.5，0.8，1.0 g·L^-1）對辣椒小孢子胚狀體誘導的影響。結果表明，基因型是辣椒小孢子胚狀體誘導的關鍵因素，供試的32個基因型中有18個誘導成功，誘導成功率56.25%，其中F1代誘導成功率達到66.67%，而自交系誘導成功率為0，各基因型中以CL-14誘導率最高，達到29.2%;不同基因型最適培養基不同，5個基因型（CL-4，CL-8，CL-10，CL-12，CL-14）中CL-4、CL-12、CL-14均以Nitsch and Nitsch為基本培養基添加適量激素誘導胚狀體最佳;不同基因型的適宜激素濃度配比不同，3個基因型（CL-4、CL-8、CL-14）中CL-8、CL-14以添加0.5 mg·L^-1 ZT和1.0 mg·L^-1

IAA效果最好;適量添加活性炭可提高小孢子胚誘導率，CL-4、CL-8、CL-14分別以添加0.8，0.5，0.5 g·L^-1誘導效果最好。

關鍵詞：辣椒;小孢子培養;花藥培養;胚狀體;單倍體

中圖分類號：S641.3 ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.04.003

Studies on Embryoid Induction of Shed-microspore Culture in Pepper （Capsicum annuum L.）

GAO Suyan1，2，3，4， LYU Jinggang1，2，3，4， JIAO Di1，2，3，4， SHANG Jipeng1，2，3，4， JIAO Dingliang1，2，3，4， HUANG Yajie1，2，3，4

（1. Tianjin Kernel Vegetable Research Institute， Tianjin 300381， China; 2.State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation， Tianjin 300381， China; 3.Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding Enterprise， Tianjin 300381， China; 4.Tianjin Vegetable Research Center， Tianjin 300381， China）

Abstract： To establish the shed-microspore culture technique system in pepper， the experiment was conducted with 32 pepper varieties as materials， the effects of genotypes（CL-1～CL-32）， culture medium （MS， Nitsch and Nitsch， NLN， B5）， hormones （ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 0.8mg·L^-1， ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1， ZT 1.0 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1， ZT 1.5 mg·L^-1+IAA 1.5 mg·L^-1）， active charcoal （0.1， 0.5， 0.8， 1.0 g·L^-1） on microspore embryos induction were studied. The results showed that genotype was the key factor for microspore embryoid induction in pepper， 18 of 32 genotypes were embryonic， and the induction success rate was 56.25%; the induction success rate of F1 generation was 66.67%， while that of inbred lines were 0; the induction rate of CL-14 was the highest （29.2%）. The optimum medium for different genotypes was different， Nitsch and Nitsch was best for CL-4， CL-12， CL-14 in 5 genotypes （CL-4， CL-8， CL-10， CL-12， CL-14）. In 3 genotypes （CL-4， CL-8， CL-14）， adding 0.5 mg L-1 ZT and 1.0 mg L-1 IAA was suitable for CL-8， CL-14 to produce embryos successfully. Adding activated carbon could improve the induction rate of microspore embryos， in which CL-4， CL-8 and CL-14 had the best induction effect by adding 0.8， 0.5， 0.5 g·L^-1， respectively.

Key words： pepper; microspore culture; anther culture; embryo; haploid

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒屬一年生或多年生草本植物，在明末傳入我國，并被廣泛種植。據2017年中國蔬菜流通協會統計，我國辣椒栽培面積占世界總面積的35%，總產量占世界的46%（數據來源于2017年遵義第二屆國際辣椒博覽會新聞發布會），辣椒產業已成為國內最大的蔬菜產業。

單倍體培養技術可以在短時間內獲得純系、縮短育種周期，受到育種家的普遍重視。早在1973年國內外就已經有通過花藥培養獲得辣椒單倍體植株[1-2]的報道，之后多位研究者對培養基組成及培養方法進行了改進[3-6]，并利用該技術選育出海花系列辣（甜）椒品種[7-9]。隨著小孢子培養技術的發展，人們開始進行辣椒的游離小孢子培養的探索并成功獲得胚狀體[10-13]。但游離小孢子胚狀體誘導率極低，雖然經過改良培養基、小孢子預處理等方法的改進，仍不能達到理想效果。利用固液雙層培養方法（小孢子散出培養法或自然游離法）既可有效減少花藥培養過程中易褐化的問題，也可減少機械游離對小孢子的傷害，該方法國內外均有成功報道[14-17]，但多應用于甜椒，并且誘導頻率較低，因此繼續對該方法進行優化，提高胚狀體誘導率，獲得雙單倍體（DH）植株及DH系才能使該技術早日應用于辣椒育種中。

本研究通過對不同類型辣椒進行自然游離小孢子的培養，分析影響小孢子胚狀體誘導的各種因素，旨在總結出適合辣椒單倍體誘導的培養方法，提高辣椒小孢子胚狀體誘導率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為32個辣椒雜交一代及自交系，來源于天津科潤蔬菜研究所辣椒課題組，于2018年4月定植于天津市農科院武清創新基地的塑料大棚中，類型包括羊角椒、牛角椒、螺絲椒、線椒;其中雜交一代品種27個，自交系5個;供試材料及主要特性見表1。

1.2 試驗方法

小孢子培養方法參考Supena[15]，并進行適當優化。具體操作過程如下：從處于始花期至盛花期的辣椒植株上選取處于單核靠邊期的花蕾置于4 ℃冰箱中預處理1～2 d;在超凈工作臺上將花蕾用70%酒精浸泡30 s，5% NaClO滅菌15 min，無菌水沖洗3～4次，用無菌濾紙吸干花蕾表面水分;用無菌刀片將花蕾剖開取出花藥并將花藥基部的花絲去除干凈，之后接種于裝有固液雙層培養基的培養皿（直徑60 mm）中，每皿接種10～12個花藥，每個處理接種3皿，設3次重復;置于9 ℃培養箱中暗培養1周，之后轉入25 ℃暗培養3～5周后再轉入光照下培養。

具體試驗設計如下。（1）基因型：上述32份材料在固體MS培養基中培養。（2）基本培養基處理：以CL-4、CL-8、CL-10、CL-12、CL-14為材料，在MS、Nitsch and Nitsch（NN）、NLN、B5液體培養基加MS固體培養基上采用自然游離培養法進行單倍體培養。（3）外源激素處理：以CL-4、CL-8、CL-14為試材，在Nitsch and Nitsch（NN）液體培養基加MS固體培養基上采用自然游離培養法進行培養，設置4個激素組合處理（ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 0.8 mg·L^-1，ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1，ZT 1.0 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1，ZT 1.5 mg·L^-1+IAA 1.5 mg·L^-1），以不添加激素作為對照（CK）。（4）活性炭（AC）處理：以CL-4、CL-8、CL-14為試材，培養基與外源激素處理相同，在下層MS固體培養基添加活性炭，濃度設置為0.1，0.5，0.8，1.0 g·L^-1，以不添加活性炭處理作為對照（CK）。

從接種30 d開始，每15 d調查1次胚狀體發生數，連續調查3次，以胚狀體數最多的1次計算胚狀體誘導率。胚狀體誘導率=（胚狀體數/接種花藥總數）×100%。

2 結果與分析

2.1 自然游離小孢子培養過程的形態觀察

將處于單核靠邊期的花藥接種于固液雙層培養基（固體MS+液體NN）中進行培養，大約5周后可出現肉眼可見的胚狀體（圖1A）;解剖鏡下觀察發現以球形、魚雷形胚狀體為主（圖1B），之后部分胚狀體繼續發育成子葉形胚狀體;培養8周后，子葉形胚狀體開始萌發并形成再生植株（圖1C、圖1D）。

2.2 基因型對胚狀體誘導的影響

在多種作物的單倍體培養研究中，基因型均是關鍵影響因素[18-20]，辣椒小孢子胚狀體誘導也同樣受基因型影響較大。從表2可以看出，在供試的32個基因型中，有18個基因型誘導胚狀體，誘導成功率為56.25%;羊角椒誘導成功率66.67%、螺絲椒誘導成功率100%、線椒誘導成功率33.33%;雜交一代誘導成功率為66.67%，自交系未能誘導出胚狀體。誘導率最高的基因型為CL-14，誘導率達到29.20%。因此，基因型是辣椒小孢子胚狀體誘導的重要因素，不同類型辣椒其誘導結果也不同。

2.3 基本培養基對胚狀體誘導的影響

選擇5個誘導率較高的基因型繼續進行基本培養基的篩選。由表3可知，以MS、NLN、Nitsch and Nitsch（NN）、B5為基本培養基均可誘導胚狀體;CL-4、CL-12、CL-14以Nitsch and Nitsch（NN）為基本培養基胚狀體誘導效果較好，誘導率較高，并且畸形胚或死亡胚數量較少，而CL-8、CL-10最適培養基為NLN，說明基本培養基的選擇會影響辣椒小孢子胚狀體誘導，不同基因型辣椒最適培養基不同。

2.4 激素配比對胚狀體誘導的影響

以CL-4、CL-8、CL-14為試材，研究在Nitsch and Nitsch（NN）上層液體培養基中添加不同濃度配比的ZT、IAA對胚狀體誘導的影響，以不添加激素為對照。由表4可知，添加激素可顯著提高辣椒小孢子胚狀體的誘導率，其中0.5 mg·L^-1 ZT+1.0 mg·L^-1IAA的激素組合分別使CL-8、CL-14胚狀體誘導率提高1.2和1.4倍，0.5 mg·L^-1 ZT+0.8 mg·L^-1IAA的激素組合使CL-4胚狀體誘導率提高2.2倍，因此，不同基因型最適激素濃度配比也不相同。

2.5 活性炭對胚狀體誘導的影響

以CL-4、CL-8、CL-14為試材，在下層固體培養基中添加不同濃度活性炭，研究活性炭對辣椒小孢子胚狀體誘導的影響。由表5可知，下層固體培養基中添加一定濃度的活性炭可提高小孢子胚誘導率，隨著活性炭濃度增加，誘導率呈先增加后下降的趨勢，CL-4、CL-8、CL-14分別以添加0.8，0.5，0.5 g·L^-1活性炭誘導效果最好。

3 結論與討論

目前，有關辣椒小孢子培養方式已有大量研究，主要是采用機械游離[12]和自然釋放[14]2種方法獲得游離小孢子，結果發現辣椒小孢子在機械積壓過程中易造成損傷從而影響誘導率，而采用固液雙層培養辣椒花藥使小孢子自然游離既減少了對小孢子的損傷，也避免了花藥培養過程中易褐化、易形成愈傷等問題[16]。本試驗采用固體MS培養基成功獲得18個基因型辣椒小孢子胚狀體，最高誘導率為29.2%（CL-14），在固液雙層Nitsch and Nitsch培養基添加適宜濃度激素，CL-14誘導率可提高至32.6%，說明通過固液雙層培養基進行辣椒自然游離小孢子培養可以獲得較高的胚誘導率，這一結果與Supena[14-15]、Esin[16]等人的研究報道相符。

培養基中添加激素可提高胚狀體誘導率，但其效果因激素種類和濃度不同而不同，甚至不添加激素的培養基也可獲得胚狀體[17]。本試驗結果亦表明，培養基中添加激素可提高胚狀體誘導率，但不同基因型最適激素濃度不相同。

活性炭對小孢子培養的影響表現在兩方面，一方面有利于吸收有害物質而促進胚狀體的形成，另一方面也會吸收激素等有益物質而妨礙胚狀體的形成。在單純固體培養基或液體培養基研究中，有的研究發現活性炭有利于小孢子胚的誘導[21]，有的研究報道發現不添加活性炭會獲得較多胚狀體[22]。本試驗將活性炭添加于下層固體培養基中，結果顯示在一定濃度范圍內有利于胚狀體發生。

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