miRNA-145、VEGF與川崎病患兒冠脈損傷關(guān)系的初步研究

顧 勇 竇常勝 邰海服

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院兒科，安徽省蕪湖市 241001

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種好發(fā)于年幼兒童的血管炎性病患[1-2]，可累及全身多處器官，以心血管后遺癥為嚴(yán)重，容易并發(fā)冠狀動(dòng)脈損傷(Coronary artery lesion，CAL)，闡明KD冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)病機(jī)制必將為其治療提供理論依據(jù)。有研究表明[3]，KD患兒血清中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)水平可出現(xiàn)明顯升高，且與KD患兒CAL相關(guān)，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。在對(duì)成年人冠心病患者冠脈損傷機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，VEGF是miRNA-145的靶基因，冠心病患者血漿miRNA-145表達(dá)明顯降低，且VEGF表達(dá)水平與miRNA-145呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)VEGF可能受miRNA-145的調(diào)控參與了冠脈損傷。但在川崎病中有關(guān)二者的表達(dá)變化及與KD冠脈損傷的關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀(guān)察川崎病患兒冠脈損傷組及非冠脈損傷組miRNA-145和VEGF表達(dá)變化及二者相關(guān)關(guān)系，初步探討KD患兒冠脈損傷的可能調(diào)控機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2018年6月在我院兒科確診為急性期川崎病的27例患兒作為觀(guān)察組，患兒入組后立刻進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，依據(jù)是否合并冠狀動(dòng)脈損傷，將患兒分為冠脈損傷組(CAL組)12例和非冠脈損傷組(NCAL組)15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入組患兒均符合日本川崎病委員會(huì)2005年第四次修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，同時(shí)參照美國(guó)多學(xué)科委員會(huì)制定的最新川崎病診斷流程。隨機(jī)選取同一時(shí)間段在我院兒童保健門(mén)診進(jìn)行健康體檢的正常健康兒童18例作為對(duì)照組，均經(jīng)嚴(yán)格篩查排除器質(zhì)性疾病。對(duì)照組與觀(guān)察組相比在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集：收集患兒外周血標(biāo)本，且所有收集的血標(biāo)本均在大劑量IVIG靜脈注射治療前進(jìn)行采集。同期收集健康對(duì)照組18例兒童外周血標(biāo)本。所有收集的血液標(biāo)本加入EDTA抗凝，經(jīng)3 000r/min離心5min，收集上清液，分裝凍存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 miRNA測(cè)定：取上述血漿樣本300μl，采用Trizol(GibcoBRL公司)和miRNeasy Mini Kit(美國(guó)Qiagen公司)按試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行RNA的提取和純化，提取RNA所用的一次性塑料器具均經(jīng)過(guò)DEPC水處理。血漿中miRNA-145的表達(dá)采用RT-PCR方法測(cè)定。取待測(cè)樣本總RNA400ng，利用Taqman miRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物(美國(guó)Applied BioSystems公司)進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，利用美國(guó)ABI 7500 Fast RT-PCR儀檢測(cè)血漿中miRNA-145的表達(dá)，反應(yīng)體系和程序設(shè)置均參照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有反應(yīng)均進(jìn)行3次平行操作，取平均值。

1.2.3 血漿中VEGF 水平的測(cè)定：ELISA法檢測(cè)血漿中VEGF (VEGF試劑盒，Abcam公司)，操作步驟參考說(shuō)明書(shū)，記錄450nm處待測(cè)樣品的OD值。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和計(jì)算待測(cè)樣品水平。

2 結(jié)果

2.1 三組VEGF、 miRNA-145比較 RT-PCR結(jié)果提示，三組之間miRNA-145差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.53，P<0.01)，CAL組患兒相對(duì)表達(dá)量低于NCAL組及對(duì)照組，NCAL組介于兩組之間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ELISA法提示 三組之間VEGF差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.87，P<0.01)，其中CAL組患兒表達(dá)量明顯高于NCAL組與對(duì)照組，NCAL組介于兩組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 miRNA-145與VEGF相關(guān)性分析 KD患兒冠脈損傷組血漿VEGF隨miRNA-145表達(dá)上調(diào)而降低，二者呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.707，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

表1 KD患兒及健康對(duì)照組血漿VEGF及miRNA表達(dá)水平

注：字母a、b、c代表三組之間均存在統(tǒng)計(jì)差異(P<0.01)。

圖1 miRNA-145和VEGF相關(guān)分析

3 討論

川崎病目前病因不是十分明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病為一種全身性出疹性血管炎癥病變，CAL是KD常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重病兒在病程進(jìn)展過(guò)程中可出現(xiàn)心肌梗死，甚至猝死，目前普遍認(rèn)為CAL可能是成年以后冠心病的重要危險(xiǎn)因素之一[7]。因此，闡明KD發(fā)生CAL的發(fā)生機(jī)制，無(wú)疑將為其治療提供重要的理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)[8]，miRNA廣泛分布于心臟及血管系統(tǒng)，并且同時(shí)參與原始心管的胚胎發(fā)育，可以來(lái)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理病理變化過(guò)程。miRNA參與心肌和血管平滑肌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，并與成年冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心律失常、心肌炎癥和血管增生等許多疾病的病理生理有關(guān)。目前已有研究表明[9]，miRNA在KD的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用，但miRNA與KD冠脈損傷的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。有研究表明[10-11]，miRNA-145與機(jī)體的血管生成的過(guò)程相關(guān), 其大量表達(dá)于小、中動(dòng)脈血管壁的平滑肌細(xì)胞中，通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能進(jìn)而影響下游因子，推測(cè)其可能參與心臟及血管系統(tǒng)相關(guān)病患的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。而VEGF則是一種具有高度保守性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其功能上可促進(jìn)中小血管通透性增加、各種細(xì)胞外液基質(zhì)變性，以及促進(jìn)中小血管內(nèi)皮細(xì)胞變移、增生和微血管再生形成等作用。有研究表明[12]，在冠心病患者血漿中，VEGF表達(dá)增高，miRNA-145表達(dá)明顯下調(diào)，并且VEGF與miRNA-145表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miRNA-145可通過(guò)影響其下游靶基因相關(guān)因子VEGF的表達(dá)，來(lái)調(diào)控血管形成和再生，從而參與了冠脈病變發(fā)生機(jī)制。對(duì)成人血管形成機(jī)制的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，VEGF是miRNA-145的靶基因，miRNA-145可以通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)參與血管的新生及血管平滑肌細(xì)胞表型的變移。

已有研究表明[15-16]，在KD患兒急性期, VEGF表達(dá)水平出現(xiàn)增高；同時(shí)伴有CAL的KD患兒，VEGF水平增高的更加明顯，提示其不僅可能參與了KD的發(fā)病過(guò)程, 而且與CAL的嚴(yán)重程度有關(guān)。但目前miRNA-145參與KD冠脈損傷的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。探討miRNA-145、VEGF與KD冠脈損傷的相關(guān)性，有助于進(jìn)一步揭示KD其形成機(jī)制，并為其治療提供理論依據(jù)。為此，本研究選擇與多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的miRNA-145和VEGF，測(cè)定其在KD急性期CAL組及NCAL組的表達(dá)水平及兩者之間的關(guān)系，探討兩者是否參與KD冠脈損傷及其可能機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-145在CAL組、NCAL組及正常對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CAL組患兒相對(duì)表達(dá)量低于NCAL組及對(duì)照組，NCAL組介于兩組之間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ELLISA法提示VEGF同樣也在三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中CAL組患兒表達(dá)量明顯高于NCAL組與對(duì)照組，NCAL組介于兩組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明miRNA-145和VEGF參與了KD的發(fā)病機(jī)制，且與冠脈損傷相關(guān)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-145和VEGF表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)系，推測(cè)miRNA-145可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)參與KD的發(fā)病機(jī)制。綜上，miRNA-145和VEGF可作為川崎病輔助診斷指標(biāo)，但由于本研究樣本量小，有一定的局限性，KD冠脈損傷的確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。