發酵肉用耐高溫酵母菌的篩選與鑒定

許艷豐 陳 瑤 劉 艷 楊萬根

吉首大學化學國家級實驗教學示范中心 吉首大學食品科學研究所 湖南吉首 416000

傳統發酵肉制品的加工周期一般較長，為了縮短生產周期，降低成本，曾經采用高溫成熟、添加蛋白酶和脂肪酶以及純種發酵等方法加速發酵肉制品的成熟[1,2]。其中，高溫成熟能促進發酵肉中風味物質之間的反應速度，提高酶的活力，但是高溫不利于發酵肉中有益微生物的生長，所得產品品質差[3～5]。純種發酵方法的主要優勢是提高了產品的安全性，雖然接種發酵菌種能一定程度上縮短發酵優勢菌的形成過程，但發酵優勢微生物的生長和蛋白酶、脂肪酶的作用仍然需要一段時間，因此成熟時間仍然較長[6,7]。如何在保證發酵肉制品質量前提下，有效縮短生產周期仍有待研究。根據前人的研究成果，將純種發酵和高溫成熟兩種方法的優勢結合起來，有可能縮短生產周期。此方法的原理是利用耐高溫發酵劑，在高溫下發酵肉制品，腐敗微生物因高溫和優勢發酵菌種的作用受到抑制，揮發性風味物質因高溫而加速生成，從而加快發酵肉制品的成熟。然而，此法的前提是要篩選到適合高溫加工的耐高溫發酵劑。酵母菌是我國傳統肉制品中的一種有益菌。因此，本文從傳統方法加工的發酵肉中分離出酵母菌菌株，然后從中篩選耐高溫、耐鹽、耐亞硝酸鹽的酵母菌，并對其進行種屬鑒定，為發酵肉加工新工藝的開發和發酵肉制品質量與安全的提高提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

臘肉，吉首市農貿市場購得；95%乙醇、蛋白胨、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、葡萄糖、瓊脂等，上海國藥集團；TH15C酵母菌微量生化鑒定管，杭州濱和微生物試劑有限公司。

YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌器，上海滬粵明科學儀器有限公司；SPX-250B-Z恒溫生化培養箱，上海博訊實業有限公司；VS-1300L-U潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；UV755CRT紫外可見分光光度計，成都蘇凈科學器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌分離

取適量臘肉樣品，攪碎后加入到YPD液體培養基中，加入鏈霉素和四環素鹽酸鹽至終濃度為25mg/L，于30℃，150r/min搖床富集培養24h后，取1mL富集液，用無菌水稀釋成不同的倍數，涂布于YPD固體平板培養基上于30℃靜止培養24h，挑取單菌落，利用TTC雙層平板法進一步篩選，把雙層平板放于30℃培養箱靜止培養24～48h，長出菌落后，選擇顏色較深，具有典型酵母菌落特征的單菌落進一步劃線分離2～3次，鏡檢為純種后轉入YPD固體斜面培養基中，于4℃保存[8～10]。

1.2.2 酵母菌篩選

1.2.2.1 產酒精能力測定

將上面篩選到的菌株分別接到YPD平板上30℃培養24h，長出菌落后將45℃TTC上層培養基倒入培養皿，30℃下避光保溫2～3h。觀察培養基顯色情況。產酒精能力強的酵母菌落一般為深紅色，次之為粉紅色，再者為微紅色。通過顏色深淺來比較各菌株的產酒精能力，篩選產酒精能力強的酵母菌株[11]。

1.2.2.2 耐鹽性測定

將分離的菌株接種到食鹽濃度為0%、2%、4%、6%、8%、10%的YPD液體培養基中，在30℃下培養24h，以YPD液體培養基做為空白對照，測定吸光值的變化，比較其生長情況，選取生長能力好的菌株進入下一步的實驗[12]。

1.2.2.3 耐亞硝酸鹽能力測定

將分離的菌株分別接種到亞硝酸鹽含量為50、100、150mg/kg的YPD液體培養基中，30℃培養24h，測定吸光度值的變化，以YPD液體培養基做空白對照，比較其生長情況，選取生長能力好的菌株進入下一步的實驗[12]。

1.2.2.4 溫度梯度篩選

將前面篩選出來的單菌落分別接入滅菌的YPD液體培養基中，在37、42、50℃條件下160r/min搖床振蕩培養，培養24h后在600nm處測定培養液的吸光值，篩選50℃生長較好的菌株。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態與培養特征

將菌株接種到YPD液體培養基中，30℃培養3～7d，觀察是否發酵、培養液是否混濁，是否形成環或島，是否有沉淀及沉淀的松緊情況，并在顯微鏡下觀察菌體，記錄酵母菌細胞的形狀。將酵母菌在YPD平板上劃線，30℃培養3～4d，記錄其菌落形態。

1.2.3.2 生理生化鑒定

將篩選得到的菌株接種于酵母菌微量生化鑒定管中，37℃培養18～72h，將實驗結果填寫在生化鑒定單上，并得出相應的編碼值，通過編碼值檢索酵母菌菌屬細菌生化鑒定編碼表，鑒定菌株種屬。

2 結果與討論

2.1 酵母分離

從湘西臘肉中采集樣本，進行涂布、劃線分離，得到40株酵母菌，編號為Y1～Y40。圖1為Y7的TTC培養基劃線分離圖。

圖1 經過多次分離劃線的Y7菌落

2.2 酵母菌篩選

2.2.1 TTC法測定產酒精能力

TTC是一種顯色劑，它對酵母的代謝產物發生呈色反應，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產酒精能力的高低。將培養在YPD平板上24h的酵母菌落上覆蓋一層TTC上層培養基，避光保溫2～3h后觀察，各株酵母菌的菌落或是不變色，或是呈現從淺粉到深紅的顏色。通過菌落顏色的深淺，可以初步判斷酵母菌產酒精能力的高低。從變色的菌株中，挑選出20株顏色深的酵母菌，編號為Y1、Y2、Y3、Y4、Y7、Y8、Y16、Y18、Y20、Y22、Y23、Y25、Y28、Y29、Y33、Y34、Y35、Y38、Y39、Y40。圖2為Y7的TTC培養基生長圖。

圖2 Y7的TTC培養基生長圖

2.2.2 耐亞硝酸鹽能力

如圖3所示，我們可以發現，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，菌株的生長開始逐漸減弱。綜合考慮，此實驗排除了編號為Y3、Y18、Y38的菌株，余下編號為Y7、Y8、Y20、Y25、Y39、Y40的6株菌株進行下面的實驗。

圖3 酵母菌耐亞硝酸鹽實驗結果

2.2.3 測定耐鹽性能力

不同NaCl濃度液體培體物的吸光度值如圖4所示。

圖4 菌株對不同濃度NaCl的耐受性實驗結果

如圖4所示，在NaCl濃度為0%、2%時，酵母菌總體生長良好，但Y1、Y2、Y16、Y22、Y23、Y28、Y29、Y34、Y35生長比較弱，故而排除。在NaCl濃度為4%時，Y33的吸光值出現了明顯的降低，生長較弱。在NaCl濃度為6%時，開始出現生長非常緩慢的情況，其中Y4菌株測得的吸光值接近空白，幾乎不生長，故而排除Y4。繼續提高鹽濃度至8%，Y3、Y8、Y18的吸光值出現負值，當鹽濃度為10%時所有菌培養液的吸光值都為負值，說明這時酵母菌均不再生長。為了提高獲得耐高溫菌株的成功概率，留下NaCl濃度為6%時生長良好的Y3、Y7、Y8、Y18、Y20、Y25、Y38、Y39、Y40進行下面的實驗。

2.2.4 溫度梯度篩選

溫度篩選實驗結果如圖5。

圖5 培養溫度篩選結果

圖5顯示，隨著培養溫度的上升，菌株的生長開始逐漸減弱。綜合考慮，此實驗排除了編號為Y8、Y20、Y25、Y40的菌株，最后留下Y7和Y39做接下來的菌種鑒定實驗。

2.3 菌種鑒定

依據菌落特征、菌體形態、生理生化特性等方法，將分離得到的耐高溫優質酵母菌鑒定到種屬。

2.3.1 形態與培養特征

Y7，Y39形態與液體培養特征見表1。

表1 Y7、Y39菌落形態與培養特征

2.3.2 生理生化鑒定

Y7、Y39的生理生化鑒定結果見表2。

表2 Y7、Y39生理生化鑒定結果

注：表中“+”為陽性，“-”為陰性。

根據酵母菌的形態學特征和表2中的生理生化特征，參考《常見細菌系統鑒定手冊》和酵母菌屬細菌生化鑒定編碼表，鑒定以上2株酵母菌分別為：Y7為熱帶念珠菌，Y39為乳酒念珠菌。

3 結論

本文從湘西臘肉中共分離出40株酵母菌，經分離、篩選后得到2株耐高溫酵母菌，分別為Y7和Y39，經過菌種鑒定后得出Y7為熱帶念珠菌，Y39為乳酒念珠菌。這些菌株有望用于發酵肉制品高溫加工工藝的開發。