肉制品中表皮葡萄球菌實時熒光PCR檢測 方法的研究

大連市檢驗檢測認證技術服務中心 遼寧大連 116600

表皮葡萄球菌是滋生于生物體表皮上的一種革蘭氏陽性球菌，因常堆聚成葡萄串狀，故名表皮葡萄球菌。在自然發酵肉制品中，表皮葡萄球菌是占據優勢地位的葡萄球菌菌種[1～5]，它們在發酵肉制品生產過程中能夠產生脂肪酶和蛋白酶，對發酵肉制品風味品質的形成起著重要作用[6]。葡萄球菌屬的許多種類其菌落形態、菌體特征相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處，傳統的生理生化實驗耗時費力，不能滿足表皮葡萄球菌檢測中的快速、準確、低成本的需要。

目前，隨著分子生物學的發展以及PCR技術的出現，許多非培養方式鑒定技術被用于葡萄球菌的鑒定[7～9]。在眾多非培養方式鑒定方法中，特異性PCR技術以其快速、準確、簡單及低成本等優點備受青睞，已得到了廣泛應用[10]。而TaqMan探針的熒光PCR檢測具有定量準確、快速、簡便、直觀的優勢，在病原菌檢測中得到廣泛的應用[11]。因此本研究旨在采用實時熒光PCR技術建立肉制品中表皮葡萄球菌檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

陽性樣本CICC10294表皮葡萄球菌，陰性樣本金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株標準菌株購于中國工業微生物菌種保藏中心。試驗所用菌株見表1。

表1 試驗用菌株

Table 1 Test strains

序號名稱來源菌種號1表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisCICC102942金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCICC216003鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimuriumCICC214844大腸埃希氏菌Escherichia coliCICC103895蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereusCICC212616蕈狀芽孢桿菌Bacillus mycoidesCICC214737蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensisCICC229458枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisCICC102759銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosCICC2163610糞腸球菌 Enterococcus faecalisCICC2365811熒光假單胞菌Psdeuomnoda fluoerncnetCICC2162412惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaCICC2054113福氏志賀氏菌Shigella flexneriCICC2153414產氣莢膜梭菌Clostridium perfringenCICC2294915白假絲酵母Candida albicansCICC196516產氣腸桿菌Enterobacter aerogenesCICC2294917阪崎腸桿菌Enterobacter SakazakiiCICC2154418副溶血性弧菌Vibrio ParahemolyticusCICC2161719單核細胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenesCICC2163320馬紅球菌Rhodococcus equiCICC2295521釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenesCICC10373

1.1.2 試劑

營養肉湯等培養基為北京陸橋公司產品，DNA提取試劑盒為廣州雙螺旋公司產品，實時熒光PCR反應試劑、Taq酶為寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器

ABI QS7 Flex熒光定量PCR儀，Eppendorf 5427R超低溫離心機，上海一恒BWS-12恒溫水浴，Promega Quantus DNA分析儀。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設計與合成

根據表皮葡萄球菌16S基因片段序列，用Primer express 3.0設計一對特異性引物和一個TaqMan探針，探針的熒光標記選擇FAM作為報告發光基團，TAMRA為淬滅基團。引物探針由上海生工公司合成。

表2 實時熒光PCR引物及探針序列

1.2.2 DNA模板的制備

將表皮葡萄球菌和其它菌株接種營養肉湯培養基，36℃培養24h。細菌增菌后，用DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA作為實時PCR的模板，-20℃保存。

1.2.3 實時PCR的反應體系和條件

實時熒光PCR擴增采用25μL反應體系，反應用各種試劑采用寶生物工程(大連)有限公司的Premix Ex TaqTM(RR390Q)試劑盒，具體各種試劑濃度、體積見表2。

表3 實時熒光PCR擴增反應體系

實時熒光PCR反應程序為：95℃預變性30s，然后進入循環反應：95℃變性5s、60℃退火和延伸30s，共40個循環。

1.2.4 特異性檢測

以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株細菌作為陰性對照，并用高純水作為無模板對照驗證實時PCR法檢測表皮葡萄球菌的特異性。

1.2.5 靈敏度檢測

以0.85%生理鹽水將表皮葡萄球菌標準菌株做成菌懸液，對菌懸液進行10倍比梯度稀釋，形成梯度含菌量為1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL的菌懸液。對每個稀釋度取1mL菌懸液進行DNA提取，提取的DNA則進行熒光定量PCR檢測。

1.2.6 實際樣品檢測

選取市售涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、生豬肉、醬牛肉、風干牛肉共5個樣品，無菌取樣25g分別加入營養肉湯培養基中，36℃培養24h。取增菌液1mL提取DNA，利用本研究的實時熒光PCR方法進行檢測。

2 結果

2.1 實時熒光PCR特異性結果

以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株細菌作為陰性對照，并用高純水作為無模板對照驗證實時熒光PCR法檢測表皮葡萄球菌的特異性。實時熒光PCR檢測表皮葡萄球菌特異性試驗見圖1。結果表明，只有表皮葡萄球菌具有擴增曲線，其他20種菌株無擴增曲線。

圖1 實時熒光PCR檢測表皮葡萄球菌特異性試驗Fig.1 Specificity detection ofqRT-PCR assay for Staphylococcus epidermidis

2.2 實時熒光PCR靈敏性結果

分別取1m表皮葡萄球菌1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL的菌懸液進行DNA提取，提取的DNA進行熒光定量PCR試驗。表皮葡萄球菌靈敏性試驗見圖2。結果顯示，表皮葡萄球菌濃度為1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL時均有擴增曲線，濃度低于1×103CFU/mL時無擴增曲線，該方法檢測的低限為1×103CFU/mL。

①1×106CFU/mL ②1×105CFU/mL ③1×104CFU/mL ④1×103CFU/mL圖2 實時熒光PCR檢測表皮葡萄球菌靈敏性試驗Fig.2 Sensitivity detection ofqRT-PCR assay for Staphylococcus epidermidis

2.3 實時PCR實際樣品檢測結果

對涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、生豬肉、醬牛肉、風干牛肉共5個樣品的營養肉湯增菌液進行DNA提取，以表皮葡萄球菌為陽性對照，進行實時熒光PCR試驗。結果顯示，涼拌豬肚和生豬肉中檢測出含有表皮葡萄球菌(見圖3)。

1.蠟樣芽胞桿菌 2.生豬肉 3. 涼拌豬肚圖3 實時熒光PCR檢測樣品中試驗Fig. 3 Detection of Staphylococcus epidermidis in samples by qRT-PCR

3 討論

在日常食品檢測中，表皮葡萄球菌一般不作為微生物檢驗的常規指標項目。但該菌抵抗力強，一般消毒劑對其無效，營養要求低，容易在食品中存活并繁殖，存活時間長，多數為非致病菌，少數可導致疾病。隨著人們生活水平的提高，對即食類產品需求量不斷增加，要求不斷提高;加上不同的人群對病菌的抵抗能力不同就容易受到表皮葡萄球菌的影響。所以有必要對該菌進行監控，以提高產品質量，降低該菌引起食品污染的風險。

長期以來，肉制品中表皮葡萄球菌檢測主要依據細菌培養、生化鑒定，該方法步驟繁瑣，且需要耗時數天的時間。常規PCR方法，雖然能夠大大縮短檢測周期，但其特異性較差，容易產生假陽性，且需要進行核酸電泳、EB染色等步驟，危害操作人員的健康。基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測方法具有高特異性、高靈敏性和可計量性，自動化程度高，無需電泳處理無污染性，且具有實時性、快速等特點[12]。

本研究設計含有不同濃度的表皮葡萄球菌(1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL)菌液樣品，試驗得到該檢測方法的低限為1×103CFU/mL。本研究通過反復摸索，建立了一套切實可行的檢測食品中表皮葡萄球菌的方法，特異性試驗和靈敏性試驗良好，該檢測方法具有特異、快速的特點，能夠滿足檢測要求，為食品中表皮葡萄球菌的快速檢測奠定了基礎。