糞腸球菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表達及酶學性質表征

陳寶莉, 秦 臻, 趙黎明

華東理工大學生物工程學院, 發酵工業分離提取技術研發中心, 生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237

N-乙酰氨基葡萄糖是生物體內許多重要糖類的組成成分，也是甲殼類動物的骨骼和真菌細胞壁的最小組成單位。N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接形成自然界中來源最廣泛的天然聚糖之一——幾丁質(chitin)[1～3]。其年儲量僅次于纖維素[4]。幾丁質水溶性差、不利于吸收，因而難以被直接使用于食品和藥品中，而幾丁質的水解產物易溶于水、生物相容性好[5]，具有更大的應用潛力。研究發現N-乙酰氨基葡萄糖具有許多重要的生理功能，例如：改善皮膚水合程度、加速傷口愈合、提高人體免疫力、改善骨關節炎和抗腫瘤等，因此被廣泛應用于醫療、食品和化妝品等多個領域[6～8]。在工業生產中，N-乙酰氨基葡萄糖目前主要通過降解幾丁質制備得到。常用的降解方法包括化學法和生物法。其中化學降解主要為酸水解和氧化降解，存在副產物較多、污染嚴重的問題；相比之下，生物降解法產物純度高，環境污染小且操作簡單，成為近年來的研究熱點[9, 10]。生物法降解幾丁質涉及多種糖苷水解酶的作用，根據作用底物和產物類型的不同可分為內切型幾丁質酶(endochitinase，EC 3.2.1.14)、外切型幾丁質酶(exochitinase，EC 3.2.1.29)、幾丁二糖酶(chitobiosidase， EC 3.2.1.29)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，EC 3.2.1.52)[11]。其中內切型幾丁質酶可隨機水解幾丁質糖鏈，得到低聚合度寡糖；外切型幾丁質酶和幾丁二糖酶可特異性作用于幾丁質的非還原端，得到幾丁二糖或單糖；β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可作用于幾丁寡糖的非還原端，最終水解得到N-乙酰氨基葡萄糖。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在自然界中的來源較為豐富，存在于多種動植物、細菌和真菌體內。CAZy數據庫(http://www.cazy.org)依據蛋白質序列進化關系對糖苷水解酶進行歸類，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶主要分布在GH3、GH20、GH84和GH116家族中。本研究涉及的糞腸球菌是人和動物腸道內重要的菌群之一，其內存在豐富的碳水化合物代謝酶系[12～14]，是發掘高效β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的潛在微生物來源。本研究克隆得到了糞腸球菌來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因EfNagase，成功進行了原核異源表達，并對其酶學性質進行了初步研究，為開發高穩定性的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,CGMCC 1.2135)由本實驗室保存；大腸桿菌感受態細胞EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)均購于康為世紀生物科技有限公司(上海)；pET-28a(+)載體由本實驗室保存。DNA Marker DL2000、蛋白Marker均購自TaKaRa公司(大連)；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒，SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA聚合酶購自Vazyme生物科技有限公司(南京)；限制性內切酶NheⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司(大連)；T4 連接酶購自New England Biolabs(美國)；對硝基苯基-N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-GlcNAc)購自Sigma公司(美國)；幾丁二糖購自Megazyme公司(愛爾蘭)；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 EfNagase序列分析

根據NCBI數據庫提供的糞腸球菌來源的GH20家族潛在糖苷水解酶基因序列(GenBank登錄號：AAO79989.1)，使用DNAMAN軟件分析核酸序列并確定酶切位點；利用Primer Premier 5軟件設計引物。利用BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析與其他蛋白的序列相似性。使用MEGA 7.0軟件按照Neighbor-joining運算方法構建系統發育樹[15～18]。

1.3 EfNagase基因擴增與原核表達

序列分析表明糞腸球菌來源的AAO79989.1基因為多結構域糖苷水解酶，包含一個GH18家族結構域(N端)及GH20家族結構域(C端)。為了獲得特異性GH20家族β-N-乙酰氨基葡萄糖酶，本研究選取該基因中GH20家族催化區進行進一步的克隆表達研究。

按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書，提取Enterococcusfaecalis基因組DNA，并以此為模板，利用聚合酶鏈式反應擴增GH20家族結構域基因(命名為EfNagase)，上下游引物分別為EfNagase-F：5′-ATTCATGCTAGCAAAAGTGTCTT-TTCCATTGATGC-3′和EfNagase-R：5′-ATTCCGCTCGAGTTATTTAACCACCATATACTCACGAT-3′(下劃線部分別為酶切位點NheⅠ和XhoⅠ)。PCR程序為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環；72℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物并膠回收。膠回收片段與載體pET-28a(+)經限制性內切酶酶切后，用T4連接酶連接。將連接產物熱激轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，挑單菌落驗證陽性克隆，重組質粒命名為pET-28a-EfNagase。將重組質粒熱激轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，挑取陽性克隆在LB液體培養基中，37℃恒溫震蕩培養至OD600達到0.6～0.8后，轉移至30℃恒溫搖床培養，用1 mmol/L的IPTG誘導表達10 h。用超聲波破碎細胞獲得粗酶液，離心收集上清液，上樣至已預平衡的Ni-IDA親和層析柱中，繼續用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)沖洗至OD280小于0.05，再用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑)洗至OD280小于0.05，除去非特異性結合蛋白，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白并收集目標組分，用SDS-PAGE檢測蛋白純度。

1.4 酶活力的測定

蛋白含量測定：采用Bradford法進行測定[19]。取100 μL適當稀釋的純酶液，加入1 mL 1×Bradford工作液，迅速混勻后室溫反應3 min。以蒸餾水作空白對照，于595 nm波長下測定吸光值。以牛血清白蛋白(BSA)為標準品繪制標準曲線，計算純酶液的蛋白含量。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活的測定(pNPG法)[20]：取100 μL 2 mmol/L pNP-GlcNAG與50 μL 0.2 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)混勻，50℃預熱10 min，加入50 μL適當稀釋的純酶溶液，迅速混勻50℃反應10 min，最后加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應。冷卻至室溫，以蒸餾水作空白對照，于410 nm波長下測定吸光值。酶活力單位(U)定義：在上述條件下，每分鐘生成1 μmoL對硝基苯酚所需的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶量為1個酶活力單位。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活的測定(3,5-二硝基水楊酸，DNS法)[21]：取350 μL溶解在0.2 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，質量分數1%的幾丁二糖溶液，再加入50 μL適當稀釋的純酶溶液，迅速混勻50℃反應10 min，最后加入600 μL DNS溶液，沸水浴煮沸10 min終止反應。冷卻至室溫，10 000 r/min離心5 min，取上清液。以蒸餾水作空白對照，于540 nm波長下測定吸光值。酶活力單位(U)定義：在上述條件下，每分鐘生成1 μmoL N-乙酰氨基葡萄糖所需的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶量為1個酶活力單位。

1.5 EfNagase的酶學性質研究

1.5.1最適溫度及溫度穩定性的測定 將純酶溶液溶于0.2 mol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液并稀釋至適當濃度，按1.4中的酶活測定方法測定該酶于不同反應溫度(35～70℃)下的酶活，以最高酶活點為100%，確定其最適反應溫度。

將純酶溶液溶于0.2 mol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液并稀釋至適當濃度，于不同溫度條件下(35～60℃)水浴保溫30 min，冰浴冷卻10 min后，按1.4中的酶活測定方法測定不同溫度條件下該酶的殘余酶活，以未經處理的酶活為100%，確定其溫度穩定性。

1.5.2最適pH及pH穩定性的測定 將純酶溶液溶于不同pH緩沖體系(檸檬酸鹽緩沖液：2.5～6.5，磷酸鹽緩沖液：5.5～8.0，Tris-HCl：7.5～9.0，甘氨酸-NaOH：9.0～13.0)中并稀釋至適當濃度，按1.4中的酶活測定方法測定該酶于不同pH緩沖體系下的酶活，以最高酶活點為100%，確定其最適反應溫度。

將純酶溶液分別溶于不同pH緩沖體系中，置于50℃水浴中保溫30 min，冰浴冷卻10 min后，按1.4中酶活測定方法測定不同pH緩沖體系中該酶的殘余酶活力，以未經處理的酶活為100%，確定其pH穩定性。

1.5.3EfNagase底物特異性 分別以天然糖類(殼二糖、殼聚糖、幾丁二糖和幾丁質)和人工合成的糖苷(pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-GlcNAc)為底物,由于EfNagase對上述天然糖類的水解活性較低，為了探索EfNagase對于上述底物是否具有催化能力，采用TLC法分析產物。將適量的天然糖類與純酶溶液混勻50℃水浴保溫1 d，用薄層層析法分析產物組成(展開劑為異丙醇:水:氨水=15∶1∶7.5)。按照1.4中酶活測定方法測定EfNagase水解人工合成糖苷的能力，以水解釋放對硝基苯酚的速率來計算酶活力。

1.5.4EfNagase動力學參數 用50 mmol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液配制11個不同濃度(0.02 mmol/L、0.025 mmol/L、0.04 mmol/L、0.05 mmol/L、0.067 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)的pNP-GlcNAc底物，加入適宜濃度的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶液，50℃分別反應5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、120 min，利用Sigma Plot軟件計算Vmax和Km值。

2 結果與分析

2.1 EfNagase序列分析

Enterococcusfaecalis來源的GH20家族潛在的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因全長1 101 bp，編碼367個氨基酸。通過NCBI數據庫中Blast結果顯示EfNagase氨基酸序列與GH20家族中的StreptococcuspneumoniaeTIGR4(AAK76198.1)來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高，為52.08%。用MEGA 7.0軟件以Neighbor-joining運算方法構建系統發育樹，分析結果(圖1)同樣顯示EfNagase與StreptococcuspneumoniaeTIGR4具有最近的進化關系。

圖1 EfNagase與GH20家族不同來源的糖苷水解酶系統發育樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of β-N-acetylglucosaminidase fromEnterococcus faecalisand GH20 family.注：基于GH20家族中不同來源的糖苷水解酶氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件采用Neighbor-joining法構建系統發育樹，序列編號附于括號中。

2.2 EfNagase基因擴增與原核表達

以Enterococcusfaecalis基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到EfNagase基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2A)得到一條大小約為1 100 bp具有特異性的核酸條帶，符合理論預期。通過限制性內切酶雙酶切反應、目的基因與載體的連接反應，挑取單菌落測序為陽性克隆，得到成功構建的重組質粒pET-28a-EfNagase。將其轉入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中后，用1 mmol/L IPTG誘導，30℃、200 r/min培養10 h。超聲波破碎細胞壁，離心取上清液，利用Ni-IDA親和層析柱分離純化。通過SDS-PAGE檢測純化產物的純度，結果(圖2B)顯示成功獲得可溶性表達的高純度的目的蛋白條帶，分子量約為40 kDa，符合預期。以pNP-GlcNAG為底物檢測純化后的EfNagase酶學性質，EfNagase的比活力為3 606.1 U/mg；以幾丁二糖為底物檢測到EfNagase的比活力為352.60 U/mg。

圖2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳(A)及重組蛋白SDS-PAGE電泳(B)結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis(A)and SDS-PAGE(B)of recombinant protein fromEnterococcus faecalis.A：M：DNA Marker；1, 2：EfNagase基因PCR產物；B：M：蛋白Marker；1：粗酶液；2：純酶液。

2.3 EfNagase酶學性質研究

2.3.1最適溫度和溫度穩定性 在相同pH條件下，測定EfNagase在不同反應溫度下(35～70℃)的酶活力。結果如圖3A所示，EfNagase為中溫酶，在50℃時酶活最高；當溫度高于70℃時，EfNagase失去活性。將酶液分別孵育于不同溫度(35～70℃)條件下30 min，按標準酶活測定方法測其殘余酶活。結果如圖3B所示，EfNagase在孵育溫度低于50℃時表現出極高的熱穩定性，酶活基本沒有損失，延長孵育時間至一周，其殘余酶活仍高于80%；當孵育溫度高于50℃，EfNagase的穩定性開始降低。

圖3 重組蛋白EfNagase的最適溫度(A)與溫度穩定性(B)Fig.3 Optimum temperature(A)and thermostablity(B)of purified recombinant EfNagase.

2.3.2最適pH和pH穩定性 在50℃，不同pH緩沖液體系中測定EfNagase的酶活力。結果如圖4A所示，EfNagase的最適pH為6.0；當pH在5.0～7.0之間時，相對酶活高于50%,且當pH 5.0～6.5時，EfNagase在檸檬酸鹽緩沖體系中的相對酶活比在磷酸鹽緩沖體系中的更高；當EfNagase在pH高于7.5的條件下，酶活明顯降低。將酶液分別溶于不同pH緩沖體系中50℃孵育30 min，按標準酶活測定方法測定殘余酶活。結果如圖4B所示，EfNagase具有極高的pH穩定性，在很寬的pH范圍內(pH 3.5～11.5)殘余酶活均高于90%；當pH低于3.0時，殘余酶活仍維持在70%以上；當pH高于12.5，殘余酶活出現了大幅度下降。

圖4 重組蛋白EfNagase的最適pH(A)與pH穩定性(B)Fig.4 Optimum pH(A)and pH stability(B)of purified recombinant EfNagase.

2.3.3EfNagase的底物特異性及動力學參數 分別以天然糖類(殼二糖、殼聚糖、幾丁二糖和幾丁質)和人工合成的pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-GlcNAc為底物。用TLC檢測EfNagase水解幾丁二糖的反應歷程，結果如圖5所示，EfNagase可在60 min內將幾丁二糖完全水解成為N-乙酰氨基葡萄糖。而EfNagase對幾丁質的水解率很低，且不能水解殼二糖、殼聚糖。用pNPG法檢測發現EfNagase對pNP-GlcNAc表現出高的水解活性，不能水解其他人工合成的pNP底物。結果表明EfNagase對幾丁二糖和pNP-GlcNAc有更高的特異性，對氨基葡萄糖衍生物沒有催化活性。以pNP-GlcNAc為底物，檢測得到EfNagase的Vmax及Km分別為520.37 μmol/min·mg和0.599 mmol/L。

圖5 薄層層析檢測EfNagase水解幾丁二糖的反應歷程Fig.5 TLC analysis of the time course of chitin disaccharides hydrolyzed by purified EfNagase.M:N-乙酰氨基葡萄糖與幾丁二糖標準品; 5,10,15,30,60,120:分別表示EfNagase水解反應了5 min,10 min,15 min,30 min,60 min,120 min。

3 討論

N-乙酰氨基葡萄糖由于其眾多重要的生理活性而備受關注，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作為酶法綠色制備N-乙酰氨基葡萄糖中具有重要意義的水解酶之一，也受到學者的廣泛研究。本研究從糞腸球菌中克隆得到的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EfNagase)，通過相似度比對和構建系統進化樹，確定其應歸屬GH20家族糖苷水解酶。目前，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶主要分布在GH3、GH20、GH84和GH116家族中，其中GH20家族的發現和研究最多。雖然目前已有報道的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶很多，但普遍存在酶活較低的缺點，大約超過70%的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活低于100 μmol/min·mg[22]。相對于其他家族的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，GH20家族的酶活更高，Microbacteriumsp.來源[23]的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解pNP-GlcNAc的比活力為1 773.1 μmol/min·mg，水解幾丁二糖的比活為481.4 μmol/min·mg；Shinellasp.來源[24]的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解pNP-GlcNAc的比活力為538.8 μmol/min·mg，水解幾丁二糖的比活為35.4 μmol/min·mg。EfNagase以pNP-GlcNAc為底物的比活為3 606.10 U/mg，以幾丁二糖為底物的比活力為352.60 U/mg，已遠高于多數其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。EfNagase在溫度50°C、pH 6.0的條件下活性最高，這和其他多數β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶性質相近。近60%的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最適溫度在37～50℃，最適pH多在5～8之間[25]。EfNagase展現出了良好的溫度穩定性，在溫度低于50℃的條件下孵育一周，其殘余酶活仍高于80%；且具有良好的pH穩定性，在pH 3.5～11.5的范圍內展現出高的穩定性(殘余酶活>90%)。適用于大部分食品、化學和醫藥工業的生產條件。研究還表明EfNagase對pNPG和幾丁二糖有較強的水解活性和底物特異性。EfNagase的優良性質為其在食品、化學、醫藥工業以及環境生物技術等領域中的應用奠定了基礎。