常規秈稻黃華占籽粒淀粉和蔗糖代謝相關酶活性對夜溫升高的響應

張文倩, 王亞梁, 朱德峰, 陳惠哲, 向 鏡, 張義凱, 武 輝, 胡國輝, 易子豪, 張玉屏

中國水稻研究所, 水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006

水稻是我國主要糧食作物，大約60%的人口以稻米為口糧。1960年以來，我國地表平均溫度升高了1.2℃，根據預測，到21世紀末，我國地表溫度還將上升2.2℃～4.2℃[1]。而溫度與水稻產量又有著密切聯系。Peng等[2]指出日最低溫度升高1℃，水稻減產10%。水稻品質形成的關鍵時期是灌漿期，有研究表明，夜溫升高影響了水稻籽粒干物質的積累和稻米品質[3]；但也有研究認為，夜溫升高加快了灌漿速率，且并未引起千粒重的下降[4]。

水稻籽粒中糙米90%的物質來源于淀粉，而淀粉是籽粒灌漿過程中主要的積累產物，其合成的過程主要包括蔗糖分解、淀粉積累。蔗糖是糖分運輸和貯存的主要形式，其可降解為葡萄糖，轉化為葡萄糖供體，之后用于合成淀粉[5]。在籽粒灌漿時期，籽粒中蔗糖的含量及其代謝相關酶的活性起著非常重要的作用。蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)和蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)是蔗糖進入各種代謝途徑所必需的關鍵酶，其中SS活性與籽粒淀粉的積累速率呈極顯著正相關[6]。任雷[7]的研究表明，溫度越高，越有利于甜瓜果實糖分的積累和蔗糖相關酶的表達。可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase，SSS)和淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)是灌漿過程中淀粉合成的關鍵酶[8]。研究表明，高溫處理下籽粒中SSS和SBE的活性會升高，直至峰值后下降[9]。

然而，目前還沒有針對夜溫升高對日間及夜間淀粉代謝生理過程的影響的研究，基于此，本研究以優質稻黃華占為材料，研究夜溫升高對不同灌漿時期的淀粉及蔗糖生理代謝變化的影響，以期明確水稻籽粒灌漿過程中氣候變化對籽粒物質積累的影響機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與盆栽方法

本研究于2017年在杭州市中國水稻研究所人工氣候箱內進行。采用盆栽種植，土壤基礎肥力為pH 5.93、有機質28.26 g/kg、全氮1.50 g/kg、堿解氮128.24 mg/kg、全磷0.87 g/kg、有效磷44.8 mg/kg、全鉀25.27 g/kg、速效鉀13 mg/kg。供試品種(組合)為優質秈稻黃華占(HHZ)，為大面積生產的主推品種，主莖葉片數14片，生育期130 d左右。

采用基質塑盤育秧，秧苗為3葉1心時移栽至裝有過篩均勻的田間細土的塑料盆中(規格：長×寬×高=20 cm×18 cm×25 cm)，每盆裝過篩均勻干土10 kg，每盆種植生長狀態一致的秧苗2穴，每穴2棵苗，每個處理6盆。每盆施用復合肥(N∶P∶K=15∶15∶15)3.0 g做為基肥，分蘗期施用尿素0.6 g，穗分化開始時施復合肥(N∶P∶K=15∶15∶15)1.8 g作為穗肥。其他管理措施同常規栽培，塑料盆內水層保持在2～3 cm。

1.2 試驗處理與溫度控制

于水稻灌漿初期P1(開花后的前10 d)、灌漿中期P2(開花后11～20 d)和灌漿后期P3(開花后21～30 d)，將生長發育基本一致的稻株單穗進行掛牌標記，整盆移入玻璃人工氣候箱內，自然光照，處理結束后再移入室外讓其自然生長，直至籽粒成熟。根據長江中下游地區單季稻灌漿期間夜間溫度變化，3個處理組的溫度設定(具體見表1)：0:00～7:00和16:00～24:00分別為21.0℃(T1)、25.0℃(T2，對照)、29.0℃(T3)，7:00～9:00分別為24.5℃、26.5℃、30.5℃，9:00～14:00均為32.0℃，14:00～16:00分別為29.5℃、30.5℃、31.5℃。氣候箱內空氣相對濕度為75%。

表1 人工氣候箱溫度設置Table1 Temperature setting of climate chamber.

1.3 測定項目和方法

于每一階段處理結束當天取樣，分別于日間12:00～13:00和夜間22:00～23:00進行。取標記穗中部同一部位籽粒，取樣樣品置于-80℃保存。

1.3.1蔗糖和淀粉含量測定 蔗糖含量測定采用蒽酮比色法[10]，淀粉含量、支鏈淀粉含量和直鏈淀粉含量測定參照何照范[11]的方法。

1.3.2蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性測定

蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性測定參照夏叔芳等[12]的方法。

1.3.3可溶性淀粉合成酶活性和淀粉分支酶活性測定 可溶性淀粉合成酶活性測定參照李天等[13]的方法，淀粉分支酶活性測定參照趙法茂等[14]的方法。

1.4 統計分析

采用Excel軟件進行數據統計及作圖，利用SAS統計軟件進行方差分析(Duncan’s)。

2 結果與分析

2.1 籽粒蔗糖和淀粉含量

由圖1A可知，T1處理的平均蔗糖含量為6.7 mg/g(鮮重)，T2處理的平均蔗糖含量為6.2 mg/g(鮮重)，T3處理的平均蔗糖含量為6.4 mg/g(鮮重)，即平均蔗糖含量：T1>T3>T2。在P1時期，不同夜溫處理蔗糖含量差異最明顯，T2、T3處理的蔗糖含量基本相同，較T2、T3處理，T1處理的蔗糖含量增加了18.2%，而在P2、P3時期，T1處理的蔗糖含量最高，T3處理的蔗糖含量高于T2處理。由圖1B可知，在P1時期，淀粉含量在不同溫度處理下差異顯著，T3處理的淀粉含量顯著高于其他2個處理，較T1、T2處理，T3處理的淀粉含量分別上升了14.0%、20.6%。說明籽粒內部蔗糖含量的變化差異主要在P1時期和P3時期，而淀粉含量變化差異主要在P1時期。

2.2 支鏈淀粉和直鏈淀粉含量

淀粉包括支鏈淀粉和直鏈淀粉2種。從圖2A可見，P2時期的不同夜溫處理下籽粒中支鏈淀粉的含量差異顯著，隨著夜溫升高支鏈淀粉含量下降，與T1處理相比，T2處理和T3處理分別下降了10.39%和33.23%。而P1時期T3處理支鏈淀粉含量最高，P3時期不同處理間差異較小。說明在灌漿初期(P1)夜溫升高利于支鏈淀粉的合成，而灌漿中期(P2)夜溫升高不利于支鏈淀粉的合成。

由圖2B可知，在不同時期，T3處理的直鏈淀粉含量均高于其他處理，且在P1時期差異最顯著，較T1、T2處理，T3處理的直鏈淀粉含量分別上升了273.3%、13.4%。灌漿期夜溫升高使直鏈淀粉含量明顯增加，且水稻灌漿初期(P1)籽粒直鏈淀粉含量上升最顯著，說明此時為影響直鏈淀粉含量的敏感時期。

2.3 可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)活性

在籽粒灌漿過程中，SSS和SBE是淀粉合成的關鍵酶。從圖3可看出，無論在日間還是夜間，T3處理下SSS活性均較小，且在P1、P2時期較T1處理酶活性顯著下降，說明灌漿初期(P1)和中期(P2)夜溫升高，SSS活性顯著下降。

圖1 不同溫度處理籽粒蔗糖(A)和淀粉(B)的含量Fig.1 The contents of sucrose(A)and starch(B)in grains under different temperature treatments.注：不同字母代表同一時期不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同溫度處理籽粒支鏈淀粉(A)和直鏈淀粉(B)的含量Fig.2 The contents of amylose(A)and amylopectin(B)in grains under different temperature treatments.注：不同字母代表同一時期不同溫度處理間存在顯著差異(P<0.05)。

圖3 不同溫度處理籽粒可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)的活性Fig.3 The activity of soluble starch synthetase(SSS)and starch branching enzyme(SBE)in grainsunder different temperature treatments.注：A.不同溫度處理在不同時期日間SSS的活性; B.不同溫度處理在不同時期夜間SSS的活性; C.不同溫度處理在不同時期日間SBE的活性; D.不同溫度處理在不同時期夜間SBE的活性。不同字母代表同一時期不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

而SBE與SSS對溫度的敏感程度并不相同。日間T3處理下P1、P2時期SBE活性明顯低于其他2個處理，表現為溫度升高酶活性下降，P3時期3個溫度處理下酶活性差異不顯著；夜間T3處理的酶活性依舊最小(平均為116.64 U/g FW)，但T2處理的酶活性最大(平均為239.2 U/g FW)，這與日間酶活性變化趨勢不一致，即夜間SBE酶活性在高溫與低溫條件下均較低。圖3主要說明T3處理(夜溫29℃)下SSS和SBE的酶活性均降低，不利于籽粒淀粉的正常合成，且P1和P2時期夜溫升高顯著影響二者活性。

2.4 蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性

SS與SPS均為蔗糖進入各種代謝途徑所必需的關鍵酶，其活性反映蔗糖生物合成途徑的能力，但隨著夜溫升高，其響應不一致。由圖4可知，SS活性在日間和夜間變化趨勢一致，P1時期，相對于其他2個處理，T3處理下酶活性顯著下降，P2時期T2處理和T3處理下酶活性顯著下降。說明SS活性受到夜溫升高的影響：P1時期夜間外界溫度升高至29℃時，酶活性顯著下降；P2時期外界夜間溫度≥25℃，酶活性顯著下降。

夜溫升高同樣顯著影響了SPS活性。P1時期，相對于其他2個處理，T3處理日間SPS活性顯著升高，但夜間酶活性顯著降低。然而，在P2時期對比T1處理，T3處理和T2處理日間SPS活性顯著降低，但夜間SPS活性有所升高。P3時期，各個溫度處理差異不大。綜上所述，SPS活性在P1時期，夜溫升高日間酶活性增大，夜間酶活性降低，P2時期則反之。說明日間酶活性也會受到夜溫升高的影響，且SPS對外界溫度變化敏感。

圖4 不同溫度處理蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性Fig.4 Activity of sucrose synthetase(SS)and sucrose phosphate synthetase(SPS)in grains under differenttemperature treatments.注：A.不同溫度處理在不同時期日間SS的活性; B.不同溫度處理在不同時期夜間SS的活性; C.不同溫度處理在不同時期日間SPS的活性; D.不同溫度處理在不同時期夜間SPS的活性。不同字母代表同一時期不同溫度處理間存在顯著差異(P<0.05)。

3 討論

本研究結果表明水稻開花后的P1時期和P2時期籽粒淀粉和蔗糖代謝相關酶活性受夜溫升高的影響較大，其中P1時期是淀粉代謝對夜溫變化最敏感的時期。灌漿初期(P1)，夜溫升高淀粉含量顯著上升，直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量也隨之上升，蔗糖含量下降；SSS、SBE和SS活性下降，SPS日間酶活性上升而夜間下降，這說明夜溫升高對酶活性的影響具有持續效應，即日間酶活性也會受到夜溫升高的影響。

灌漿初期(P1)為夜溫升高對淀粉積累影響的敏感時期。而后2個時期的溫度處理，對淀粉積累影響較小。這與呂艷梅等[15]研究灌漿期高溫對水稻籽粒淀粉形成的影響的結果相似，但其也表明高溫易使灌漿提前結束。從品質角度出發，直鏈淀粉的含量是影響稻米品質的重要因素。有研究表明，直鏈淀粉含量低，稻米食味值較好[16,17]。而在本研究中，直鏈淀粉含量均隨著夜溫升高而增加，且在P1時期增幅最顯著，可見此時是影響直鏈淀粉含量的敏感時期，夜溫升高影響了水稻的稻米品質，這與張桂蓮等[18]的研究結果相似，其認為抽穗結實期高溫使直鏈淀粉含量增加。

Mayer等[19]和Wilhelm等[20]指出，SSS對高溫十分敏感，也有研究表示灌漿早期高溫處理可明顯提高SSS的酶活性[21]。通過本研究可以發現，P1和P2時期夜間溫度升高，使得HHZ日間和夜間SSS酶活性均顯著降低，且在P1時期日間與夜間不同溫度處理SSS活性差異最明顯。而SBE在P1時期夜間高溫與低溫活性均較低，這與金正勛等[22]的研究結果相吻合，其發現SBE活性對溫度變化的響應較為迅速，溫度過高或過低該酶的活性都會降低。

SPS利于降解后的運輸產物在其催化下形成蔗糖，由本研究結果可知，P1時期高夜溫減緩夜間籽粒內蔗糖合成，P2時期高夜溫減緩日間籽粒內蔗糖合成。而SS的主要作用是催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖，為淀粉合成提供底物。本研究中，SS在不同夜溫下其活性差異明顯，在P1時期夜溫29℃時，其酶活性最小，即在高夜溫下通過蔗糖合成酶途徑分解蔗糖的能力下降，此時可能影響籽粒內的淀粉合成，也有研究表明[14]高溫會抑制灌漿期籽粒蔗糖合成酶活性，可能會導致淀粉合成受阻。

在本研究中，淀粉含量隨著夜溫升高而上升，然而，灌漿過程中淀粉合成的關鍵酶，可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶，活性均下降。這主要是由于籽粒內淀粉積累合成是一個復雜的過程，水稻淀粉的合成需要通過一系列酶促反應完成，除了本研究已測定的可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶，還包括ADPG焦磷酸化酶、顆粒結合型淀粉合酶、淀粉去分支酶和淀粉磷酸化酶[23]。因而，在后續試驗中可基于此展開深入的研究。此外，本次研究中試驗時期獨立分為3個階段，并未對灌漿全過程中不同階段進行探究，且設置3個溫度處理，溫差分別為3℃、7℃、11℃，而目前較小幅度的夜間增溫對水稻灌漿影響的生理機制，以及夜間增溫與日間增溫對籽粒結實具體影響的差異尚不明確，有待進一步探索。