利用生物信息學方法解析自噬相關基因在人體紅細胞終末分化各階段的動態表達

徐長祿, 趙艷紅, 馬藝戈, 王冰蕊, 王 鼎, 郭 青, 佟靜媛, 高 潔, 李亞樸, 劉金花, 石莉紅

中國醫學科學院&北京協和醫學院血液病醫院(血液學研究所), 實驗血液學國家重點實驗室, 天津 300020

細胞自噬是指在自噬相關基因的調控下，降解細胞自身受損或無關細胞器，以此維持細胞自身的更新和活力。細胞自噬可以分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬3種形式，當細胞受到饑餓、缺氧、病原體感染等因素刺激時，即可啟動細胞自噬[1,2]。

人體紅細胞為造血譜系中的一支，由具有多向分化潛能的造血干細胞分化而來[3]。成熟紅細胞的生成需要多種生物學過程參與，而細胞自噬在紅細胞生成過程中發揮著重要作用，尤其是紅細胞終末分化階段的線粒體、核糖體及其他細胞器的清除過程[4]。但是，有關自噬相關基因在人體紅細胞終末分化各階段的整體表達概況及其生物學作用的研究尚無報道。本研究利用生物信息學方法對人體原始紅細胞、早期早幼紅細胞、晚期早幼紅細胞、中幼紅細胞及晚幼紅細胞5個階段的轉錄組數據進行分析，以期探討自噬相關基因在各階段的動態表達。

1 材料與方法

1.1 數據來源及類型

紅細胞終末分化各階段轉錄組數據來源于已發表文獻[5]，An等[5]通過流式細胞儀檢測、細胞形態學觀察及功能性實驗分選出每個階段的細胞，然后對各階段紅系終末分化細胞(人體原始紅細胞、早期早幼紅細胞、晚期早幼紅細胞、中幼紅細胞和晚幼紅細胞)進行轉錄組測序，每個階段3個重復。本研究下載上述5個階段紅細胞的轉錄組數據，對3個重復取平均值，從中選取自噬相關基因的表達值。

1.2 自噬相關基因集的獲得

人體自噬相關基因集取自Autophagy Database[6]和Autophagy Regulatory Network(ARN)[7]，兩者取交集獲得人體自噬相關基因747個。

1.3 基因注釋

基因注釋由DAVID[8]完成，DAVID為經典的基因注釋數據庫，基因注釋信息可靠。其中，Gene Ontology(GO)選取標準為P<0.05、FDR<0.05，且每條注釋信息至少包含10個基因。利用REViGO[9]對符合篩選標準的GO Terms進行分類及總結。REViGO對輸入的GO Terms進行比較，然后通過文本相似性總結出具有代表性的基因注釋信息。

1.4 數據分析平臺及統計學分析

利用R編程語言(https://www.r-project.org)進行數據分析及實驗結果可視化，P<0.05且FDR<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 自噬相關基因在紅細胞終末分化各階段的表達模式

在747個人體自噬相關基因中，共有726個基因在紅細胞終末分化各階段表達，在此基礎上，去除在所有樣本中表達之和小于1的基因，共獲得可用于后續分析的自噬相關基因535個。對其在紅細胞終末分化各階段的表達概況進行分析，其中，100個自噬相關基因在原始紅細胞及早幼紅細胞中表達較低，而在中幼紅細胞及晚幼紅細胞中表達較高(圖1，Pattern 1)；271個自噬相關基因在原始紅細胞及早幼紅細胞中表達較高，而在中幼紅細胞及晚幼紅細胞中的表達逐漸減弱(圖1，Pattern 2)；164個自噬相關基因僅在晚幼紅細胞中表達較低(圖1，Pattern 3)。同時，通過圖1左側的基因聚類分析也可得出自噬相關基因在紅細胞終末分化各階段共有3種表達模式。

2.2 表達模式Pattern 1自噬相關基因集的注釋

利用DAVID數據庫對符合表達模式Pattern 1的100個自噬相關基因進行注釋，選用默認參數，共獲得756個GO Terms，在此基礎上，設置P<0.05、FDR<0.05，且每條注釋信息至少包含10個基因為篩選條件，最終獲得128個GO Terms。利用REViGO對符合篩選條件的GO Terms進行總結，分析結果如圖2所示，該組基因能夠富集到細胞應激反應、細胞器解體、分子功能的調節、蛋白質磷酸化、巨自噬、自噬、囊泡運輸等生物學過程。

2.3 表達模式Pattern 2自噬相關基因集的注釋

經DAVID數據庫注釋，表達模式Pattern 2的自噬相關基因得到了1 189個GO Terms，篩選(標準同2.2)之后，最終獲得265個GO Terms。利用REViGO對符合篩選條件的GO Terms進行總結，結果如圖3所示，自噬的調節、囊泡介導的運輸、凋亡過程、蛋白質磷酸化、自噬為Pattern 2主要富集的生物學過程。

圖1 人體自噬相關基因在紅細胞終末分化不同階段的表達Fig.1 Expression of human autophagy related genes in different stages of terminal erythrocyte differentiation.

圖2 表達模式Pattern 1自噬相關基因集注釋結果Fig.2 Gene ontology of Pattern 1 autophagy genes.

圖3 表達模式Pattern 2自噬相關基因集注釋結果Fig.3 Gene ontology of Pattern 2 autophagy genes.

2.4 表達模式Pattern 3自噬相關基因集的注釋

經DAVID數據庫注釋，表達模式Pattern 3的自噬相關基因得到了188個GO Terms，篩選(標準同2.2)之后，最終僅獲得9個GO Terms。利用REViGO對符合篩選條件的GO Terms進行總結，結果如圖4所示，Pattern 3主要富集到蛋白質磷酸化、囊泡介導的運輸、巨自噬、自噬等生物學過程。

圖4 表達模式Pattern 3自噬相關基因集注釋結果Fig.4 Gene ontology of Pattern 3 autophagy genes.

2.5 3種不同表達模式自噬相關基因集的綜合分析

為了探究3種不同表達模式的自噬相關基因集的差異，分別選取各表達模式基因富集的前10個GO Terms(表1)。通過比較可知，富集到自噬、巨自噬生物學過程中的有3種不同表達模式的基因集；而富集到線粒體解體和線粒體自噬的主要為Pattern 1基因集；Pattern 2和Pattern 3基因集富集的GO Terms相似，這也符合兩者基因表達的模式，即隨著紅細胞的逐漸成熟，兩者的基因表達呈現下降趨勢(圖1)，同時自噬的調節、蛋白質的轉運及磷酸化在兩者中有較高的富集。

表1 Pattern 1、Pattern 2、Pattern 3基因集中前10個GO TermsTable1 Top ten GO Terms of Pattern 1, Pattern 2, Pattern 3.

3 討論

1967年，Deter和De Duve[1]首次提出自噬這個概念。隨后，研究表明細胞自噬對生物體的生長發育具有重要意義[2]。紅細胞的生成是一個動態的過程，在該過程中，最明顯的變化是紅細胞形態及其內容物的變化，因為正常成熟紅細胞不具有細胞核、線粒體及其他細胞器，這些物質的清除在紅細胞成熟的過程中非常重要。借助慢性粒細胞白血病細胞系K562，Fader和Colombo[10]發現在紅細胞成熟過程中存在著自噬現象。

目前，針對紅細胞終末分化發育階段自噬的研究主要集中在具體自噬基因的作用[11]，而忽略了自噬相關基因在不同發育階段的整體概況。本研究主要是利用高通量測序數據，結合生物信息學分析手段，對自噬相關基因在紅細胞終末分化各階段的表達進行研究。通過數據分析可知，自噬相關基因在人體原始紅細胞、早期早幼紅細胞、晚期早幼紅細胞、中幼紅細胞和晚幼紅細胞5個階段的表達呈現出動態變化的趨勢。同時，基因聚類分析結果表明，可根據基因表達的時序，將所有自噬相關基因分為3種表達模式：Pattern 1在原始紅細胞及早幼紅細胞中表達較低，而在中幼紅細胞及晚幼紅細胞中的表達逐漸增高；Pattern 2與Pattern 1表達模式幾乎相反；Pattern 3僅在晚幼紅細胞中表達較低。

Cao等[12]通過對Atg7基因敲除小鼠的觀察發現紅細胞的分化被阻滯在原始紅細胞階段，同時在自噬信號通路被上調的WT小鼠中，晚幼紅細胞數量顯著增加。這表明Atg7在原始紅細胞中具有重要作用，同時反映了自噬與紅細胞分化緊密相關；此外，刺激自噬信號通路可以動員紅系祖細胞的增殖和分化，最終表現為成熟紅細胞的增加[12]。在本研究中，Atg7的表達模式屬于Pattern 2，即在原始紅細胞及早幼紅細胞中高表達，也與之前的實驗結果[12]相似。同時，這也提示了與Atg7表達模式相同的自噬相關基因在紅細胞終末分化的早期發揮著重要作用。從圖1可以看出，有超過50%的自噬相關基因在原始紅細胞階段呈現高表達狀態，這表明自噬在紅細胞發育的早期顯得比較重要，但并不意味著自噬在紅細胞發育的晚期不重要。

研究發現，unc-51樣激酶(unc-51 like kinase 1，ULK1/Atg1)基因在紅細胞成熟的最后階段具有重要作用，是線粒體自噬的關鍵基因[13]。線粒體自噬最早由Lemasters[14]提出，該團隊發現，當線粒體膜電位降低及線粒體內膜電導率滲透過渡孔隙打開時可引起線粒體自噬。線粒體是為細胞提供能量的場所，在其供能的同時會產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS的堆積可對線粒體造成傷害，進而誘導細胞凋亡[11]。而自噬相關基因的缺失則會導致線粒體的清除障礙，進而影響紅細胞的成熟，并最終造成貧血。Mortensena等[15]的研究發現，Atg7-/-敲除小鼠有核紅細胞中存在受損線粒體堆積的現象，而這些受損線粒體能夠改變細胞膜電位，最終導致細胞死亡。因此，為了維持細胞內環境的穩定及細胞本身的正常增殖、分化，適時清除線粒體顯得尤為重要。本研究發現，富集到線粒體自噬相關通路的主要為表達模式Pattern 1的基因集，該基因集在紅細胞成熟的后期(即中幼紅細胞及晚幼紅細胞)呈現高表達狀態。這種現象提示，在紅細胞終末分化的早期階段(原始紅細胞及早幼紅細胞)，細胞蛋白質合成、轉運及磷酸化等生理過程較為活躍，此時消耗的能量較多，線粒體也呈現出活躍狀態。但隨著細胞進程的發展，蛋白質等相關物質的合成及積累已滿足生理活動的需要，而線粒體由于前期的活躍狀態，ROS等有害物質的堆積較多，因此，為了保持細胞的正常狀態，線粒體自噬相關基因被啟動。

同時，正確理解線粒體自噬在紅細胞生成中的具體機制有助于紅細胞相關疾病的預防和治療[4]。盡管線粒體自噬對紅細胞的生成和行使正常的功能至關重要，但也有研究人員指出，在不同的研究模型和基因中，線粒體自噬缺失的程度對紅細胞生成的影響也是不同的[16]，因此通過比較不同研究中線粒體自噬相關的機制，并找出其共性顯得尤為重要。

本研究利用生物信息學方法對紅細胞終末分化各階段的轉錄組數據進行解析，從中提取自噬相關基因的表達。經分析比較可知，在紅細胞終末分化的早期(即原始紅細胞、早幼紅細胞)，50%以上的自噬相關基因已經表達，這表明早期的自噬活動對紅細胞的分化及成熟紅細胞的生成至關重要。在紅細胞終末分化的后期(即中幼紅細胞、晚幼紅細胞)，線粒體自噬相關基因的表達增高，這提示了線粒體自噬在紅細胞成熟的最后階段發揮著重要作用。綜上所述，本研究描繪了自噬相關基因在紅細胞終末分化各階段的表達呈現出動態變化的現象，并表明不同表達模式的基因集在不同階段的表達程度亦不同，基因注釋結果有利于對紅細胞生成及成熟過程的認識，更為進一步的機制研究提供了思路。