人源化Mesothelin嵌合抗原受體介導的T細胞抗腫瘤效果

劉圓圓, 牛 卿, 馮曉明

中國醫學科學院&北京協和醫學院血液病醫院(血液學研究所), 實驗血液學國家重點實驗室, 天津 300020

實體瘤的有效治療是患者的福音，免疫療法的發展為實體瘤的治療帶來可能，目前有很多免疫療法在被積極探索，比如：免疫限制點(如PD-1/PD-L1、CTLA-4等)抑制劑單克隆抗體、靶向腫瘤發生過程關鍵因子的單克隆抗體、腫瘤疫苗、免疫細胞療法等[1～3]。CAR-T細胞(嵌合抗原受體T細胞)作為一種過繼性免疫細胞療法在近年引起了廣泛的關注，其在急性B淋巴細胞白血病的治療中取得了舉世矚目的成果[1]。CAR-T細胞利用基因修飾的方法，在T細胞表面表達特異性識別腫瘤表面抗原的單鏈可變識別區(scFv)，避免了MHC限制性而實現腫瘤細胞表面抗原直接激活T細胞的殺傷功能。第一代CAR-T將scFv與CD3ζ串聯表達在T細胞表面，第二代和第三代CAR-T在第一代的基礎上通過串聯或并聯的方式在CD3ζ基序前加上了CD28/41-BB(CD137)等共刺激分子的胞內段[4,5]，增強了CAR-T細胞的增殖、存續和殺傷等能力。那么，在腫瘤發病率中占了約90%的實體瘤，是否能夠被CAR-T有效治療呢？該問題目前還在初探階段。

為了探索CAR-T細胞對于實體瘤的治療作用，本研究選擇了Mesothelin作為治療靶點，進行體外和體內治療效果的探索。間皮素(Mesothelin)是一個40 kDa的通過糖脂酰絲氨酸(GPI)錨定在細胞膜表面的糖蛋白，在胸膜、腹膜、心包膜的間皮細胞上有表達，但是在胸膜間皮瘤、卵巢癌或胰腺癌上存在過量表達，Mesothelin的過表達與腫瘤的侵潤和遷移有關[6～8]。有研究已開發出抗Mesothelin的單克隆抗體amatuximab[8]以及Mesothelin 疫苗 CRS-207、GVAX 和 DNA Vaccines[7]，目前臨床實驗雖然顯示出一定的療效，但并不如意。當前已有不少靶向Mesothelin的CAR-T應用于治療胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等臨床試驗，已公布的臨床試驗使用的CAR-T多使用鼠源的scFv，試驗結果提供的證據表明其具有一定的有效性和安全性[6]，但是在消除腫瘤、延長患者生存期、減少及避免副反應等方面還需做出更多的探索。

為更好地模擬人類疾病及臨床應用，本研究構建了抗間皮素的人源化P4 scFv與41-BB和CD3ζ胞內信號串聯的表達載體，成功制備了P4 CAR-T細胞，觀察了其在體外和體內實驗中對人宮頸癌腫瘤的殺傷功能，探討了P4 CAR-T細胞對于表達Mesothelin腫瘤相關抗原的特異性識別功能，為CAR-T進一步改造以提高實體瘤治療效果的探索及臨床試驗提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系

293T細胞系、HeLa細胞系、Nalm-6細胞系來自本實驗室，SKOV3細胞系來自中國醫學科學院血液學研究所細胞庫。

1.2 細胞培養試劑

培養293T細胞系和SKOV3細胞系使用含10% FBS(Gibco)的DMEM培養基，培養HeLa細胞系和Nalm-6細胞系使用含10% FBS(Gibco)的1640培養基，這兩種培養基均添加10 U/mL青霉素，10 μg/mL鏈霉素，1% HEPES(10 mmol/mL)，1% L-谷氨酰胺(2 mmol/mL)，1%丙酮酸鈉(1 mmol/mL)。消化貼壁細胞使用0.25% Trypsin-EDTA。培養人CD3+T細胞使用ImmunoCult-XF T細胞擴增培養基(stem cell)，刺激T細胞用CD3/CD28抗體(25 μL/mL，ImmunoCultTMHuman CD3/CD28 T cell activator，stem cell)鋪板，添加細胞因子IL-2(100 ng/mL, PeproTech)，10 U/mL青霉素，10 μg/mL鏈霉素。

1.3 儀器與設備

二氧化碳培養箱(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置光學顯微鏡(Nikon公司)；BD FACS Aria III 流式細胞分選儀(Becton Dickinson公司)；BD FACS Canto II流式細胞分析儀(Becton Dickinson公司)；轉盤式共聚焦顯微鏡(PerkinElmer UltraVIEW公司)；熒光顯微鏡(Zeiss Imager公司)；酶標測試儀(ImageQuant，GE公司)；臺式低速離心機(Thermo Fisher Scientific公司)；臺式高速離心機(Eppendorf公司)；熒光定量PCR儀(ABI公司)；普通PCR儀(ABI公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1人源化靶向Mesothelin的CAR載體構建

人源化靶向Mesothelin的scFv片段(即P4 scFv)來源于文獻的氨基酸序列[9]，進行密碼子優化得到了核苷酸序列。在華大基因公司合成融合基因序列，依次包含信號肽CD8a(序列號NM_001768)、P4 scFv(依次為重鏈VH和輕鏈VL)、CD8鉸鏈區(序列號NM_001768)、CD8跨膜域(序列號NM_001768)、41-BB胞內段(序列號XM_011541386)和CD3ζ胞內段(序列號EF364119)。將融合基因克隆到pCDH載體上(購自SBI公司,SYSTEM BIOSCIENCES)，菌落PCR(引物CD3ζF和M13R，表1)鑒定克隆成功，將該載體命名為P4-CAR(圖1)。

圖1 P4 CAR的結構模式圖Fig.1 The constructure of P4 CAR.

1.4.2慢病毒的制備 采用四質粒慢病毒包裝系統，Rev 2.5 μg，VSVG 3 μg，pMDL 5 μg，目的質粒12 μg。轉染前24 h，將對數生長期的293T細胞鋪到10 cm細胞培養皿中，轉染時細胞密度為70%～80%。使用天根試劑盒進行質粒抽提，目的質粒P4-CAR，空白對照質粒pCDH。將質粒按照上述系統與67.5 μL轉染試劑PEI(聚乙烯亞胺)混合后轉入換成無血清培養基的293T細胞，4 h后將培養基換成完全培養基，分別在24 h、48 h、72 h收集病毒原液。超速離心法處理病毒原液(20 000 r/min，4℃，2 h)，用T細胞培養基將病毒沉淀重懸，0.22 μm濾器除菌，濃縮后體積為病毒原液的1/25。當天使用置于冰上備用，長期保存置于-80℃冰箱。

1.4.3CAR-T細胞制備 CD3+T細胞來自中國醫學科學院血液病醫院的健康供者，淋巴細胞分離液差速離心提取人外周血單個核細胞，再通過流式細胞術分選獲得純的CD3+T細胞。種入細胞前用CD3/CD28抗體(25 μL/mL)鋪板，培養CD3+T細胞使用T 細胞擴增培養基。刺激3 d后，將細胞計數、離心；取病毒濃縮液，加入polybrene(10 μg/mL)，用病毒液重懸CD3+T細胞，種入48孔板中，離心感染(2 000 r/min，常溫，80 min)。感染8～12 h后換液，48 h后檢測感染效率。再培養3～5 d，適時換液并將細胞逐步移到更大體積的培養皿中。

1.4.4流式細胞術 通過流式細胞術檢測感染效率，依次使用Mesothelin Fc蛋白(ACRO system)和anti-Fc抗體(APC，Biolegend)進行兩步染色，BD CantoⅡ流式分析儀檢測。CD3+T細胞分選時染色抗體使用anti-human CD3(APC，Biolegend)，通過BD FACS Aria III流式細胞分選儀分選。

1.4.5PCR檢測 構建載體使用菌落PCR檢測；檢測表達Mesothelin蛋白的基因MSLN在細胞系上的表達時，采取Trizol法抽提RNA，反轉錄(全式金試劑盒)獲得cDNA，進行普通PCR，通過凝膠成像系統顯示結果；RT-PCR(Real-time PCR)使用SYBR GREEN(Life Technologies)法通過ABI Stepone 熒光RT-PCR儀進行擴增及檢測。引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列Table1 Primer names and sequences.

1.4.6共聚焦顯微鏡檢測 使用Mesothelin Fc蛋白和anti-Fc抗體兩步染色，將細胞懸液小心滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，2 h之內使用轉盤式共聚焦顯微鏡拍攝，捕獲單個細胞的視野拍攝，獲取熒光和明場下的影像，并進行疊加。

1.4.7熒光素酶體外殺傷實驗 制備表達熒光素酶(Luciferase)的慢病毒，感染HeLa腫瘤細胞系，用嘌呤霉素(1 μg/mL，索來寶)篩選出穩定表達熒光素酶的腫瘤細胞系。提前24 h將腫瘤細胞鋪板；按照效應T細胞和腫瘤細胞(effecter T cells: tumor cells,E∶T)1∶1的比例分別將CAR-T細胞和對照T細胞種入孔內，此時記為0 h，在24 h、48 h之后分別取出孔板內的細胞，離心、裂解后與底物D-熒光素鉀鹽(15 mg/mL, YEASEN)的反應(避光)，使用酶標儀檢測熒光素酶與底物反應情況。

1.4.8熒光顯微鏡拍照 制備穩定表達GFP的HeLa腫瘤細胞系，提前24 h，將腫瘤細胞鋪板；按照E∶T為1∶1或2∶1的比例分別將CAR-T細胞和對照T細胞種入孔內，此時記為0 h，在24 h、48 h后使用熒光顯微鏡拍照，觀察GFP陽性的腫瘤細胞被殺傷的情況。

1.4.9小鼠模型及體內實驗 從中國醫學科學院血液學研究所實驗動物中心訂購6～8周的雌性NSG小鼠。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，約10 min麻醉倒，再剃去右下肢背側的毛，每組4只。皮下注射HeLa腫瘤細胞，每只6×105個細胞。觀察小鼠的腫瘤成型狀況，待可見腫瘤后，通過游標卡尺測量腫瘤大小，根據公式腫瘤體積(mm3)=1/2(長度×寬度×寬度) 計算腫瘤大小。分別在第21天(D21)、第48天(D48)、第53天(D53)通過尾靜脈注射向小鼠輸注1×105個CAR-T細胞(體積為200 μL)，對照組輸注同等體積的PBS(圖2)。持續監測腫瘤大小和小鼠生存期。

圖2 體內實驗技術路線Fig.2 The technique roadmap of in-vivo experiment.

1.5 統計學分析

采用Excel軟件和GraphPad Prism軟件進行數據整合和分析，RT-PCR檢測Mesothelin表達和熒光素酶體外殺傷實驗采用unpairedt-test，腫瘤大小統計學用two way-ANOVA和unpairedt-test，生存曲線用Log-rank (Mantel-Cox) Test。

2 結果與分析

2.1 P4 CAR-T細胞的構建

2.1.1表達載體的結構 合成包含人源化anti-Mesothelin scFv P4[9]的融合基因序列，該序列依次包含信號肽CD8a、P4 scFv(依次為重鏈VH和輕鏈VL)、CD8鉸鏈區、CD8跨膜域、41-BB(CD137)胞內段和CD3ζ胞內段(圖1)。采用分子克隆技術，將融合基因克隆到表達載體pCDH 上。通過菌落PCR鑒定，凝膠成像結果表明該表達載體構建成功。

2.1.2P4 CAR-T細胞的感染效率 293T細胞系作為包裝細胞，四質粒系統進行慢病毒包裝。為了更好地模擬患者的治療狀況以及后續實驗需要，未使用表達GFP的載體來計算病毒滴度，用病毒原液重新感染293T細胞流式檢測CAR分子的表達觀察，病毒包裝效率均能達到90%以上。檢測完成后，進行超速離心濃縮病毒。流式分選獲得人CD3+T細胞，用pCDH和P4 CAR病毒濃縮液分別感染刺激活化的T細胞，并在體外擴增。采取流式染色的方法檢測CAR-T細胞的感染效率，P4 CAR的表達可達50%(圖3A,B)。為了更直觀地觀察CAR分子在細胞表面的表達，通過共聚焦熒光顯微鏡拍照成像，發現CAR分子在T細胞表面是成簇表達的(圖3C)。

圖3 CAR分子的表達情況Fig.3 The expression level of CAR molecule.注：A, B：流式染色檢測CAR分子在T細胞表面的表達水平。C：共聚焦顯微鏡檢測CAR分子在T細胞表面的表達情況，左圖為熒光通道成像，中間圖為明場成像，右圖為兩種通道的融合。

2.2 腫瘤細胞表達抗原檢測

文獻報道表達Mesothelin分子的有HeLa人宮頸癌細胞系[10,11]、SKOV3人卵巢癌細胞系[12]等，以293T細胞和Nalm-6細胞作為陰性對照，使用Trizol法提取4種細胞的RNA，反轉錄獲得cDNA，進行PCR反應，通過凝膠成像系統檢測PCR產物，可定性確定這兩種細胞均表達Mesothelin的mRNA，但HeLa細胞的表達量更高(圖4A)。進一步通過RT-PCR相對定量檢測，使用293T細胞作為陰性對照，同樣驗證了上述結果(圖4B)，Mesothelin mRNA在HeLa細胞和SKOV3細胞中的表達水平明顯高于293T細胞。進行統計學分析，在SKOV3細胞中P<0.05，HeLa細胞中P<0.000 1，HeLa細胞中的表達高于SKOV3細胞，選擇HeLa細胞系用于后續實驗。

2.3 P4 CAR-T細胞體外殺傷能力檢測

采取影像學觀察和檢測腫瘤細胞Luciferase(熒光素酶)的方法來判斷P4 CAR-T細胞體外殺傷HeLa細胞的能力。分別用搭載GFP和Luciferase的慢病毒載體感染HeLa細胞，制備穩定表達GFP蛋白和Luciferase的HeLa細胞系，作為體外殺傷實驗的靶細胞。將pCDH T和P4 CAR-T與GFP+HeLa細胞(即E∶T)按照1∶1的比例在96孔板中共培養，使用熒光顯微鏡檢測24 h后的孔板中的GFP熒光。可觀察到，P4 CAR-T組的綠色熒光明顯少于pCDH T組，明場視野下看到pCDH T細胞分散，而P4 CAR-T細胞成團，被殺傷的腫瘤細胞失去原有梭形形態，熒光呈現出來為片狀或點狀的細胞碎片。說明P4 CAR-T發生活化且對GFP+HeLa細胞有明顯的殺傷作用(圖5A)。進一步進行定量檢測，分別將這兩種T細胞與Luciferase+HeLa細胞按E∶T為1∶1的比例在96孔板中共培養，在24 h和48 h檢測孔板中剩余細胞的Luciferase的表達情況。24 h和48 h的檢測結果對比后可見(圖5B)，P4 CAR-T組剩余細胞Luciferase的表達水平明顯低于pCDH T組和HeLa細胞組(P<0.01)，而pCDH T組和HeLa細胞組無明顯差異，這說明P4 CAR-T對于Luciferase+HeLa細胞有明顯殺傷作用，且到48 h基本殺傷完全；而pCDH T對Luciferase+HeLa細胞基本沒有殺傷作用。增大E:T的比例，將pCDH T和P4 CAR-T與GFP+HeLa細胞分別按照E∶T為1∶1和2∶1的比例在96孔板中共培養，使用熒光顯微鏡檢測記錄0 h、24 h、48 h各孔中的GFP熒光，可見到同一天時P4 CAR-T的兩組中綠色熒光明顯少于pCDH T的兩組，而且P4 CAR-T的比例越高熒光越弱(圖5C)，而對照組的熒光強度幾乎沒有減少，反而隨著細胞增殖在增加。說明P4 CAR-T能夠在體外殺傷表達Mesothelin的HeLa細胞，且隨著CAR-T細胞比例增加，殺傷效率增強。

圖4 腫瘤細胞系表達Mesothelin分子Fig.4 The expression level of Mesothelin in tumor cells.注：A．凝膠成像系統拍照結果。MSLN是表達Mesothelin的基因名稱，GAPDH是內參基因。B. RT-PCR檢測細胞系表達Mesothelin mRNA的水平， *和***分別表示在P<0.05和P<0.0001水平差異顯著。

圖5 P4 CAR-T細胞體外殺傷能力Fig.5 The efficacy of killing tumor cells by P4 CAR-T cell in vitro.注：A. pCDH T細胞和P4 CAR-T細胞分別與GFP+HeLa細胞按照E∶T為1∶1的比例共培養，24 h后在熒光顯微鏡下拍照，左邊為明場下的成像，右邊為GFP熒光通道下的成像。B. pCDH T細胞和P4 CAR-T細胞分別與Luciferase+HeLa細胞按照E∶T為1∶1的比例共培養，分別在24 h和48 h后使用酶標儀檢測孔板中剩余腫瘤細胞的熒光素酶的表達情況，**表示在P<0.01水平差異顯著。C. pCDH T細胞和P4 CAR-T細胞分別與GFP+HeLa細胞按照E∶T為1∶1和2∶1的比例共培養，HeLa細胞為對照，分別在0 h、24 h、48 h時熒光顯微鏡下拍照。

2.4 體內實驗檢測P4 CAR-T細胞的實體瘤抑制效果

將HeLa細胞皮下注射到NSG小鼠的右下側背部，未發生免疫排斥并長出腫瘤，約20 d后用游標卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積長到300～500 mm3，實體腫瘤模型構建成功。將所有小鼠隨機分成2組：對照組和P4 CAR-T組，通過尾靜脈注射回輸CAR-T細胞，數量為1×105，分別在D21、D48、D53注射。持續觀察小鼠的腫瘤生長情況，測量并統計腫瘤大小(圖6A)。從D20起，對照組的腫瘤體積始終大于實驗組，注射后的實驗組的組間差異小于對照組。分別對同一天測量兩組腫瘤大小進行unpairedttest，D58、D63、D73對照組的腫瘤明顯大于P4 CAR-T組(P<0.05)，因D66和D70兩組分別有一只小鼠死亡，故在D73最后一次測量腫瘤大小(圖6B)，但兩組的腫瘤都是持續增大的。從小鼠生存期來看(圖6C)，在D66，對照組的小鼠開始死亡，D94對照組的4只小鼠全部死亡；P4 CAR-T組在D70第一只小鼠死亡，D105最后一只小鼠死亡，最終所有小鼠均死亡。相比對照組生存時間最長的小鼠，注射了P4 CAR-T的小鼠的生存期延長了11 d，對照組的中位生存時間為80 d，P4 CAR-T組的中位生存時間是87.5 d，進行Log-rank (Mantel-Cox)統計，P=0.307 6，故P>0.05，無顯著統計學差異。從體內實驗來看，P4 CAR-T能夠抑制Mesothelin陽性的實體腫瘤的增長，并且能夠延長生存期。但是不能消除腫瘤，最終小鼠因為腫瘤負荷過大而死亡。這提示我們P4 CAR-T對于Mesothelin陽性腫瘤具有潛在的治療效果，但改善體內治療效果的進一步增效策略是必要的。

3 討論

CAR-T細胞療法在B淋巴細胞惡性白血病中顯示了極好的效果，相關細胞產品CART-019已獲得FDA的批準。但目前在全世界的報道中，CAR-T細胞治療實體瘤還存在極大的挑戰。The Street 網站上在2015年公布了諾華公司和賓夕法尼亞大學以Mesothelin作為首個實體瘤靶點進行CAR-T臨床試驗的結果，該細胞使用了來自鼠源的scFv SS1串聯CD28共刺激結構域，5位實體瘤患者參與，但總體效果并不明顯，且有副作用。

圖6 體內實驗檢測P4 CAR-T的抗腫瘤效果Fig.6 The antitumor effects of P4 CAR-T cells in vivo.注：A.實驗組和對照組的NSG小鼠的腫瘤大小變化趨勢；B. D53, D58, D63, D73檢測的兩組小鼠的腫瘤大小比較，*表示在P<0.05水平上差異顯著。C.體內實驗小鼠的生存曲線。

為了進一步探索Mesothelin作為靶點在腫瘤免疫治療方面的潛力，本研究選取全人源化的P4 scFv串聯共刺激分子41-BB(CD137)及CD3ζ結構域，構建二代CAR-T，通過體外和體內實驗驗證以P4 scFv為基礎的CAR-T細胞治療人宮頸癌的可能性。研究表明，41-BB作為共刺激分子，可減少T細胞的耗竭，增強T細胞對抗原的敏感度，促進T細胞向記憶細胞分化，增強T細胞的存續能力[13～15]，我們使用該共刺激分子替換大多研究中使用的CD28分子。我們的實驗表明，P4 CAR融合蛋白可在人源T細胞表面穩定表達，在體外有效地殺傷靶細胞，在動物實驗中可以延緩腫瘤生長及延長小鼠的生存期。本研究以更好地模擬臨床上實體瘤患者的病程和治療為出發點，診斷出腫瘤后再實施治療，并且謹慎地探索CAR-T細胞的回輸數量和時機。目前很多研究在體內實驗中，選擇較早的時機注射CAR-T細胞，甚至實體瘤未完全形成，能夠在一定程度上證明體內的殺傷效應，但與臨床實際情況并不十分相近。從實體瘤治療所面臨的問題來說，我們做了一定的探索結果表明：Mesothelin這個抗原作為CAR-T細胞治療靶點深入研究，使用人源化scFv以及聯用41-BB共刺激分子能夠促進CAR-T的抗腫瘤效應。

目前許多國家開展了anti-Mesothelin CAR-T的基礎研究、臨床前研究及臨床試驗[6,8,16,17]，證明了這個探索方向的研究價值，但要真正做治療實體瘤的臨床轉化還有待推動。對于CAR-T有效性和安全性的提升，基礎研究者還需做更多的工作，將限制CAR-T細胞治療實體瘤的因素一一擊破或聯合解決。利用CAR-T細胞治療實體瘤的難點在于：①確定特異性表達的腫瘤細胞表面標志物[4,18]；②腫瘤組織被包膜包裹，形成一個相對獨立的空間，藥物等難以突破包膜接觸到腫瘤細胞[19]；③腫瘤組織包含有抑制性的腫瘤微環境，包括抑制性的細胞(調節性T細胞，髓系來源的抑制性細胞，M2型巨噬細胞等)以及抑制性的細胞因子(IL-4,IL-10,IL-35等)[20,21]。提升CAR-T細胞有效性的手段主要包括：①改善CAR-T在體內的增殖和存續能力，可改造CAR表達載體的結構，比如嘗試尋找更強的共刺激分子，如41-BB[13,14]、ICOS[22,23]等；CAR-T細胞共表達促進增殖的細胞因子，如IL-18[24]、IL-7[25]；也有研究通過溶瘤病毒共表達細胞因子IL-2和TNF-α[26]。②為促進CAR-T細胞浸潤腫瘤組織，共表達趨化因子，如CCL19[25]、CCR2[27]；也有研究在腫瘤原位注射CAR-T細胞，增加CAR-T細胞與腫瘤細胞直接接觸的幾率[28, 29]。③抵抗腫瘤周圍的抑制性微環境中也有策略，阻斷免疫檢查點PD-1[30]，或將抑制性的信號轉換為活化信號，如PD1-CD28轉換型受體[31]。④探索注射CAR-T細胞合適的劑量和時機。增強CAR-T的安全性的策略有：①尋找特異性的腫瘤特異性表面抗原，抵抗治療中的on target-off tumor作用，能夠更加有效安全地治療實體腫瘤[4,18]。②采用不同的CAR基因編輯方法，使其表達在T細胞表面，減少慢病毒轉導體系帶來的安全隱患，發展了mRNA轉導體系[32]、睡美人轉座子系統[33]等。

CAR-T細胞治療實體瘤依然存在極大的挑戰，但是這個方向是值得探索的。本研究驗證了包含人源化的P4 scFv及41-BB共刺激結構域的CAR-T細胞在實體瘤治療中的可行性，為后續的研究提供了基礎。實驗室研究中需要嘗試更多的方案提高CAR-T細胞的有效性和安全性。