Foxp3+調節性T細胞在播散性毛孢子菌病小鼠模型的表達研究

敖俊紅，祝 賀，廖 勇，楊冬倩，李海濤，楊蓉婭

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T. asahii）是毛孢子菌屬中重要的臨床致病菌，可導致深部感染和夏季超敏性肺炎，T. asahii是播散性毛孢子菌病的主要病原菌[1,2]。近年來，隨著糖皮質激素和免疫抑制劑的應用，以及腫瘤、血液病、艾滋病的增多，該病發病率逐年上升[3-5]。T. asahii進入宿主體內后是否致病，由宿主的免疫防御狀態和菌株致病力等因素決定。國際上報道由阿薩希毛孢子菌所致的播散性毛孢子菌病幾乎均是在惡性腫瘤、白血病基礎上繼發感染所引起。由阿薩希毛孢子菌引起的播散性感染較難治愈，癥狀容易反復，預后較差[6]。因此，了解宿主感染阿薩希毛孢子菌過程中限制保護性免疫應答的因素可能為進一步研發有效的靶向治療措施提供免疫學理論基礎。CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞是一類可調節其他免疫細胞增殖、分化與功能，維持機體免疫穩態和免疫耐受的CD4+T淋巴細胞亞群，在自身免疫性疾病、腫瘤、器官移植及慢性感染等疾病中發揮重要作用。轉錄因子Foxp3（forkhead box p3）是調節性T細胞的特異性標志，對調節性T細胞發育、分化及功能維持起重要作用[7]。研究發現在一些病原微生物如利士曼原蟲、單純皰疹病毒及白念珠菌等感染中，調節性T細胞及細胞因子白細胞介素（IL）-10、轉化生長因子（TGF）-β1參與炎癥免疫反應并發揮保護性或有害性作用。本研究旨在觀察播散性阿薩希毛孢子菌病小鼠模型中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞表達情況，并探討其可能發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種T. asahii標準株（CBS2479）購自荷蘭皇家學院真菌多樣性中心（CBS）。菌種-80℃保存，接種1個月前經小鼠感染預試驗活化。

1.1.2 動物 BALB/c 雄性小鼠，50只，由中國醫學科學院動物所提供，體重20～22 g，許可證號：SCXK-2012-0004。隨機分為試驗組和對照組（各25只）。

1.1.3 試劑 熒光抗體PE-Cy?5 Rat anti-mouse CD4、FITC Rat anti-mouse CD25、Rat anti-mouse Foxp3購自美國BD Biosciences公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司；Foxp3和β-肌動蛋白引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：Foxp3：5"-TTCGAGGAGCCAGAAGAGTTTC-3"，5"-GGGCCTTGCCTTTCTCATC-3；內參β-肌動蛋白：5"-CC ACAGCTGAGAGGGAAATC-3"，5"-TCTCCAG GGAGGAAGAGGAT-3"。

1.1.4 實驗儀器 ST16R高性能通用臺式冷凍離心機 （美國賽默飛世爾科技有限公司），型號為BD ACCURI C6流式細胞分析儀（美國BD Biosciences公司），ABI7000實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。

1.2 方法

1.2.1 接種 挑取單克隆菌落，接種于沙堡培養基（SDA）上培養7 d，以無菌生理鹽水沖洗培養基斜面收集菌落，將菌液經12層無菌紗布過濾，血球記數板記數調整孢子懸液濃度為3.2×107cfu/ml。試驗組小鼠尾靜脈注射菌懸液每只0.3 ml，對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水每只0.3 ml。

1.2.2 取材 分別于接種后第3，7，14，21及28天，每次每組各取5只小鼠，3.6%水合氯醛（每只0.2～0.3 ml）麻醉小鼠后，超凈臺解剖小鼠并完整摘取脾臟，無菌生理鹽水沖洗干凈。

1.2.3 流式細胞儀檢測小鼠脾臟單個核細胞中Foxp3+調節性T細胞比率 每次每只小鼠取1/3脾組織，用針栓研磨后200目篩網過濾，PBS洗滌后取100 μl細胞懸液，加入PE-Cy?5 Rat anti-mouse CD4 5 μl，FITC Rat anti-mouse CD25 5 μl，避光 4℃孵育30 min，用PBS 洗去游離的抗體，加紅細胞裂解液1 ml，5 min，PBS洗兩遍。加入新鮮配制固定/破膜劑1 ml，避光4℃孵育45 min，perm/wash buffer洗2遍，100 μl PBS重懸后加入PE Rat anti-mouse Foxp3 抗體 5 μl，避光 4℃孵育 50 min，PBS洗去游離的抗體，重懸后用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+T淋巴細胞的比率，未與抗體作用的細胞懸液作為空白對照。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測小鼠脾臟Foxp3 mRNA相對含量 Trizol提取脾臟組織總RNA，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，應用SYBR Green染料法，通過ABI7000定量PCR儀檢測。以相同的cDNA擴增目的基因，分別取cDNA 1 μl加入PCR八連管，依次加入UltraSYBR Mixture 10 μl,目的基因上下游引物各 0.5 μl，無菌蒸餾水 8 μl，構成 20 μl反應體系，每個樣品做3次重復。擴增條件：95℃預變性10 min，變性95℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃32 s，共40個循環。結果根據目標基因和內參基因β-肌動蛋白得到的Ct值，采用2-△△Ct法進行樣品間相對定量分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠脾臟單個核細胞Foxp3+調節性T細胞比率

試驗組小鼠脾臟單個核細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+T細胞的比例第3天為（7.33±0.49）%，與對照組（7.73±0.61）%相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；第7 天為（9.93±0.91）%，較對照組出現明顯上升（7.90±0.40）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；第14天達到高峰，為（15.13±1.06）%，與對照組（7.60±0.56）%相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；其后逐漸下降，第21天為（11.03±0.85）%，與對照組（7.60±0.96）%相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；第28天降至正常水平（8.23±0.50）%，與對照組（7.53±0.51）%相比，差異無統計學意義（P＞ 0.05）（圖 1，2）。

圖1 不同感染時間小鼠脾臟組織CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞流式細胞圖

圖2 不同感染時間小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+T細胞比例

2.2 小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達情況

試驗組小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達水平第3天為（1.36±0.31），較正常對照組（1.13±0.41）升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；第7天為（1.90±0.23），較對照組（1.30±0.37）升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；第 14天 為（2.59±0.55），較正常對照組（1.40±0.36）升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；第21天為（1.93±0.23），與對照組（1.38±0.36）相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；第 28天 為（1.26±0.22），與對照組（1.18±0.07）相比，差異無統計學意義（P＞ 0.05）（圖 3）。

圖3 不同感染時間小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達水平

3 討論

調節性T細胞通過抑制效應T細胞增殖及細胞因子的產生來維持免疫內環境穩態[8]。在一些真菌感染性疾病中，調節性T細胞數目增多或功能增強，一方面可以避免過度炎癥反應對感染部位造成的病理性損傷，對機體起到保護性作用；另一方面，調節性T細胞抑制有效免疫應答同時減弱機體清除病原微生物的能力，從而導致感染持續存在[9]。調節性T細胞發揮免疫抑制作用主要通過兩種途徑：①通過細胞-細胞直接接觸抑制多種效應細胞及抗原提呈細胞的活化與功能。調節性T細胞膜表面組成性地高表達負性調節因子細胞毒素T淋巴細胞抗原-4(cytotoxin T lymphocyte antigen，CTLA-4)，CTLA-4可以與輔助性T淋巴細胞（helper lymphocyte T，Th）細胞表面共刺激分子CD28競爭性結合共刺激配體B7，在適應性免疫應答后期下調T淋巴細胞的活化。②分泌抑制性細胞因子作用于效應T淋巴細胞，如IL-10、TGF-β1。IL-10不僅可以抑制Th1細胞合成干擾素（IFN）-γ，還可以抑制單核/巨噬細胞、樹突狀細胞抗原提呈能力，具有抑制炎癥反應的發展和減輕炎癥損傷的作用[10]。TGF-β1可以抑制巨噬細胞和NK細胞活化，阻斷活化T細胞的增殖和IL-2的產生，同時能促進誘導性調節性T淋巴細胞的分化，促進損傷組織的修復[11]。有研究發現，在白念珠菌、煙曲霉、副球孢子菌的感染過程中，調節性T細胞及細胞因子IL-10、TGF-β1表達增高并抑制過度炎癥反應，從而發揮保護性或有害性作用[12-14]。筆者既往研究也發現，IL-10、TGF-β1參與小鼠T. asahii感染后免疫應答反應，可能減弱了機體清除T. asahii的能力，為T. asahii的存活提供了有利條件[15]。

T. asahii引起的播散性感染會導致全身免疫系統的改變，為探討調節性T細胞在T. asahii引起的播散性感染中作用機制，筆者對播散性毛孢子菌病小鼠脾臟中調節性T細胞及其轉錄因子Foxp3 mRNA表達水平進行測定，結果發現試驗組小鼠在接種菌懸液后第7天，脾臟CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞及Foxp3 mRNA表達水平開始較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義；在第14天達到最高值（最高可達正常對照組2倍），其后逐漸下降，至第28天下降至正常水平。以上研究結果表明，T. asahii可以誘導小鼠體內CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在感染中后期表達增高，調節性T細胞可能參與調節播散性毛孢子菌病的免疫應答反應，這與白念珠菌、煙曲霉、副球孢子菌等研究結果相似[12-14]。本研究結果表明，調節性T細胞參與小鼠播散性毛孢子菌病感染免疫應答反應。調節性T細胞可能抑制了機體抵御T. asahii感染的有效免疫應答反應，減弱了機體清除T. asahii的能力，為阿薩希毛孢子菌的存活提供了有利條件。但調節性T細胞在播散性毛孢子菌病中發揮的確切免疫效應及具體作用機制仍需進一步體內和體外實驗研究。