大別山冬青離體快繁技術

方宇鵬, 戴啟培

(池州職業技術學院 園林系,安徽 池州 247000)

大別山冬青(IlexdabieshanensisK.Yao & M.B.Deng)，又名霍山冬青，為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)闊葉常綠喬木，是我國特有的植物,原產于安徽省西部的大別山地區，在海拔150～470m的溝邊及山坡路邊野生生長。其果實紅艷，葉色翠綠，生長勢極強，且耐修剪，耐瘠薄干旱，有很強的適應性，是珍貴的園林綠化樹種。此外，大別山冬青可制作保健飲料苦丁茶，具有降脂及消炎等藥用保健的功效，有十分廣闊的市場應用前景[1,2]。池州職業技術學院于2013年開始對大別山冬青扦插繁殖進行研究，但繁殖系數低。目前所繁殖植物僅用于苦丁茶制作，園林應用尚未有報道。為開發推廣利用大別山冬青這一種質資源，本文在前人研究的基礎上，運用正交試驗法，篩選并建立大別山冬青離體快繁體系，以期為實現大別山冬青工廠化育苗、加快其推廣應用等方面提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為安徽省安慶市太湖縣宏安冬青樹種植農民專業合作社提供的5年生扦插苗。2017年5月中旬取無病蟲害、生長健壯的當年生枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒處理 用自來水將具有腋芽的一年生枝條沖洗30min，然后去除葉片，留少量葉柄，放入盛有洗衣粉溶液的燒杯中漂洗，并不斷攪動，洗凈后瀝干，移至超凈工作臺上。75%的酒精消毒20s后用無菌水沖洗5次后，再將其放于0.1%的升汞液中消毒8min，然后用無菌水沖洗3～5次，最后將莖段表面的水分用無菌紙吸干[3,4]。最后將經過消毒的莖段(外植體)剪切成約0.5～1.0cm長的莖段，每莖段帶1～2個腋芽，接種到初代培養基上誘導腋芽萌發。

1.2.2 腋芽誘導培養 通過L9(33)的正交試驗法，將培養基設計為9個不同的組合，最終篩選出最佳大別山冬青的芽誘導培養基組合。正交試驗中所用基本培養基為WPM、B5和MS,細胞分裂素NAA的質量濃度分別設為0、0.3及0.5mg·L-1,而6-BA的質量濃度分別設為0.5、1.0及1.5mg·L-1。每個培養瓶中分別接種3個莖段，每種試驗處理分別接種10瓶，重復三次。外植體接種后置于(23±3)℃，光照2000Lx，16h/d的條件下培養。觀察腋芽的生長狀況,培養30d后開始統計各處理的誘導率和其新稍的長度。利用正交設計的相關軟件助手對統計的數據進行分析，以此篩選大別山冬青最佳的誘導培養基組合。

1.2.3 繼代增殖培養 前期初代培養誘導后產生的新梢，經過切割處理后轉接到含不同濃度配比生長調節劑的增殖培養基中。根據外植體在不同處理下初代培養基中誘導分化情況，以MS培養基為繼代增殖培養基，并添加6-BA及IBA作為生長調節劑，其濃度配比分別為：6-BA設0.5mg·L-1和1.0mg·L-1，IBA設0.3mg·L-1和0.5mg·L-1。將經過初代培養后的嫩梢進行切割，隨機接種到不同的繼代增殖培養基中，每瓶2個莖段，各莖段帶一個新腋芽。每個處理接種10瓶，重復三次，培養周期為30d。觀察芽增殖情況，計算大別山冬青叢生芽增殖率，篩選最佳繼代增殖培養基。

1.2.4 生根培養 將長至3～4cm高的健壯大別山冬青試管苗接種到4種生根培養基上進行生根誘導：(1)1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA1.0mg·L-1；(2)1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.5mg·L-1；(3)1/2MS+NAA0.5mg·L-1+IBA1.0mg·L-1；(4)1/2MS+NAA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1。觀察根系生長情況，40d統計生根率，從中篩選最佳生根培養基。

1.2.5 煉苗移栽 大別山冬青生根后的組培苗株高4cm左右時可進行煉苗與移栽。選擇根系發達、生長健壯的組培苗，先將瓶蓋打開，覆上保鮮膜在人工氣候室內放2～3d。再從培養瓶中取出小苗，洗除根部的培養基，移栽至消毒過的泥炭土、珍珠巖和蛭石混合的基質中。前期適當遮陰，保持一定的濕度，25d后統計成活率。

1.3 數據處理與分析

利用Excel作圖后進行數據分析和處理，方差分析采用SPSS18.0軟件。

2 結果與分析

2.1 培養基及生長調節劑濃度對初代培養的影響

大別山冬青接種15d后，各處理腋芽均有一定程度的膨大，25d后觀察發現有腋芽萌發。由表1中數據可見，三個因素中(細胞分裂素NAA的質量濃度、基本培養基和6-BA的質量濃度)，影響大別山冬青生長及其腋芽萌發的主要因素為6-BA質量濃度的高低，基本培養基種類影響次之，而細胞分裂素NAA的質量濃度對初代培養影響最小。此外，由表1可知，大別山冬青腋芽萌發率及新稍的生長隨著6-BA質量濃度的升高，呈先增加后降低的趨勢。三種培養基對大別山冬青腋芽的萌發都具有一定的誘導作用，但其中WPM培養基的誘導效果不明顯。通過不同的試驗處理及結果分析可見，大別山冬青腋芽誘導最佳的培養基為MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1，其腋芽誘導率高達100%。

表1 培養基及生長調節劑對大別山冬青腋芽的誘導影響

2.2 不同質量濃度的生長調節劑對大別山冬青繼代培養的影響

將大別山冬青初代培養后的新芽通過繼代接種到增殖培養基中，培養基中含不同濃度的生長調節劑。通過繼代培養30d后，對叢生芽的增殖情況進行統計。結果發現，不同濃度的生長調節劑組合對大別山冬青叢生芽增殖的影響差異顯著。

由表2分析可見，大別山冬青經初代培養后的嫩枝接種在不同質量濃度的IBA和6-BA配比的MS培養基上時，隨著6-BA質量濃度的升高，大別山冬青的增殖系數呈升高趨勢。當IBA質量濃度為0.5mg·L-1時，增殖效果不明顯。當6-BA質量濃度為1.0mg·L-1、IBA質量濃度為0.3mg·L-1時，增殖效果最好，與其它處理間呈顯著差異。因此，大別山冬青叢生芽增殖的最佳培養基為MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1。

2.3 大別山冬青組培苗生根培養

將高3～4cm健壯生長的大別山冬青試管苗分別接種到含不同生長調節劑的生根培養基中進行誘導生根處理。培養15d后觀察可發現，大別山冬青組培苗開始產生不定根；25d后可見大量須根。由表3可見，不同質量濃度的生長調節劑NAA和IBA可在一定程度上誘導大別山冬青組培苗生根。但當NAA質量濃度為0.1mg·L-1，IBA質量濃度為0.5mg·L-1時，生根率相對較低，生根所需時間長，平均根長短，不定根數量較少；隨著生長調節劑NAA的質量濃度增加，大別山冬青的生根率及不定根的數量呈升高趨勢，且最長根長和平均根長也逐漸增加。當生根培養基中添加0.3mg·L-1的NAA和0.2mg·L-1的IBA時，大別山冬青的組培苗誘導生根率高達95%，不定根數量達6.8條，平均根長達2.6cm，不定根數量及平均根長均與其他處理間差異顯著。因此，從綜合生根率及根系質量可知，最適宜大別山冬青組培苗生根的培養基是1/2MS+NAA0.3mg·L-1+IBA0.2mg·L-1。

表2 不同質量濃度的生長調節劑對大別山冬青繼代增殖的影響

注：增殖系數統計結果為平均值±標準差，其中差異顯著(p<0.05)以小寫字母表示。下同

Notes：The multiplication coefficient is average value ± standard deviation.The significant difference(p<0.05)was expressed in different lower letters

表3 生長調節劑濃度對大別山冬青組培苗根的誘導影響

2.4 大別山冬青組培苗馴化移栽

大別山冬青生根后的組培苗長至4cm高時，將根系發達、生長健壯的組培苗，經馴化后移栽至消毒過的蛭石(V)：珍珠巖(V)：泥炭土(V)按2:1:2混合的基質中，控制外界環境條件，移栽后25d，植物長勢良好，成活率可達85%。

3 結論與討論

大別山冬青是園林綠化中一種珍貴的優良樹種，在保健飲料中還可制作為苦丁茶，具很好的降脂、消炎等保健和藥用功效，有很好的的市場開發效益及廣闊的應用前景。通過對大別山冬青的組織培養技術進行研究，可快速增加大別山冬青的繁殖系數，對大別山冬青種質資源的利用及創新應用有重要意義。目前，市場上大別山冬青主要通過扦插進行繁殖,但扦插繁殖系數較低，且受生長季節等外界環境條件影響[5,6]。為提高大別山冬青在園林綠化中的應用范圍及藥用生產價值,急需通過其它高效育苗途徑提高其繁殖率。組織培養技術可在很大程度上提高繁殖系數,培養體系建立后,通過組培技術可在短時間內獲得大批量優質的種苗[7,8],這對豐富我省綠化樹種、推動大別山冬青的園林應用及苦丁茶制作有極大的意義。但目前，大別山冬青組培技術鮮有報道。本項目采用大別山冬青當年生嫩枝莖段為外植體進行組培快繁，探索出大別山冬青離體快繁體系,以此技術手段為后期大別山冬青的推廣應用及開發提供了有效的試驗依據和技術指導，促進了大別山冬青這一優質樹種的產業化生產，在生產上具有重要的現實意義。

在植物的組培過程中，選擇適宜的培養基對大別山冬青的誘導分化及器官的再生培養有重要作用。因此，以MS、B5、WPM為基本培養基，通過正交試驗設計不同的培養基組合，篩選出最適宜大別山冬青腋芽誘導的培養基。試驗結果發現，采用WPM培養基作為基本培養基時，腋芽的誘導率較低；采用MS培養基作為基本培養基時，誘導率較高，且其他指標也優于WPM及B5培養基。這與前人在木本植物組織培養中的研究較為一致[9-12]。作為廣泛使用的MS培養基，其微量元素齊全，硝態氮和銨態氮含量相對較高，而WPM及B5培養基中銨態氮含量低，硝態氮含量則較高[13]，高比例的銨態氮和硝態氮可能對大別山冬青的誘導分化有一定促進作用。

植物生長調節劑種類、配比及濃度在植物的離體快繁中，也對外植體的誘導分化有很大影響[14]。向培養基中添加不同生長調節劑對外植體的內源激素水平有一定的影響，因此不同濃度生長調節劑及配比的培養基對外植體誘導分化能力產生明顯影響[15]。本試驗在初代培養中，選擇不同的生長調節劑，腋芽萌發情況差異較大。隨著NAA質量濃度的升高，大別山冬青腋芽萌發率呈先增高后降低趨勢；而隨著6-BA質量濃度的增加，腋芽萌發率的變化無明顯規律。通過正交試驗，結果可得知，以MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1作為培養基是最適宜腋芽誘導的培養基，其腋芽萌發率高，新稍生長快。可見，在組織培養過程中，植物生長調節劑對促進細胞伸長生長有一定的作用。

試驗中，通過觀察發現，基部愈傷組織在外植體腋芽萌發時形成。將其處理后進行增殖培養的同時，在原培養基中繼續培養原外植體。后期基部產生的愈傷組織，使其繼續培養萌發新芽。但5次繼代后，基部不再有愈傷組織形成，莖段上也不再有新的腋芽萌發。該現象與冬青莖段的組織培養研究結果一致[16,17]。試驗結果表明，外植體基部愈傷組織的形成與腋芽的萌發有一定的關系。在增殖培養過程中，發現6-BA誘導效果優于IBA，在30d內，可使增殖系數高達3.6。但是在繼代過程中，發現隨著繼代次數的增加，部分愈傷組織出現褐化，導致大別山冬青愈傷組織褐化的原因很多，可能與外界的環境條件、培養基種類及狀態、生長調節劑種類及類型等有關，具體原因有待于進一步試驗研究。

試驗結果表明，1/2MS培養基中添加生長調節劑可誘導大別山冬青組培苗生根。吳月燕等[18]研究發現：IBA質量濃度在一定的范圍內，IBA質量濃度對內源IAA的含量有影響，并隨著IBA質量濃度的增加呈升高趨勢[18]；外源NAA則對內源IAA的合成有促進作用，對促進根的形成有一定作用[19]。本試驗研究發現，隨著NAA質量濃度的增加，生根率逐漸增加。但相同質量濃度NAA條件下，IBA質量濃度過高，生根率反而下降。可見，大別山冬青組培苗生根情況與生長調節劑種類及質量濃度配比有一定的關系。

通過本試驗研究，建立了以莖段作為外植體的大別山冬青組培快繁技術體系，得出大別山冬青初代培養最佳培養基為MS培養基，且添加6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1是最適宜腋芽誘導的培養基。繼代增殖培養則以MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1最適宜,增值系數最高。組培苗生根培養基以1/2MS+NAA0.3mg·L-1+IBA0.2mg·L-1最宜，生根率達95%，根系發達。經生根后的試管苗移栽至蛭石(V)：珍珠巖(V)：泥炭土(V)=2:1:2混合基質，控制環境條件，成活率可達85%。本試驗研究建立的大別山冬青組培快繁體系，為加快大別山冬青的推廣應用奠定了重要的技術基礎。