異維A酸對肽聚糖誘導的SZ95人皮脂腺細胞相關(guān)炎癥基因表達的影響

曹珂 侯霄梟 李昕 Christos C.Zouboulis 鞠強

1上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院皮膚科 200127；2Departments of Dermatology,Venereology,Allergology and Immunology,Dessau Medical Center,Brandenburg Medical School Theodore Fontane，Dessau 06847,Germany

尋常痤瘡是毛囊皮脂腺慢性炎癥性疾病，炎癥貫穿痤瘡發(fā)生的始終。痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）通過活化Toll樣受體2（Toll-like receptor，TLR2）誘導天然免疫反應(yīng)及炎癥因子如白細胞介素（IL）1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及腫瘤壞死因子（TNF）釋放，在痤瘡炎癥進程中起核心作用［1］。異維A酸具有抑制皮脂腺脂質(zhì)合成、改善毛囊皮脂腺導管角化、間接抑制P.acnes增殖及抗炎作用，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可以同時影響?zhàn)畀?個主要發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物［2］。近來對異維A酸的抗炎作用研究多集中于患者治療后的血清學檢測或者外周血單核細胞因子表達變化［3-5］，體外針對痤瘡發(fā)生中具有核心作用的皮脂腺細胞免疫和炎癥的調(diào)節(jié)作用特別是對TLR2介導的天然免疫通路影響的相關(guān)研究仍然缺乏。為此，我們探討異維A酸體外對革蘭陽性細菌（包括P.acnes）壁主要成分肽聚糖誘導的SZ95人皮脂腺細胞中與痤瘡發(fā)病可能相關(guān)的炎癥因子的表達釋放和TLR2基因及其下游MyD88（myeloid differentiation factor 88）基因表達的影響，探討異維A酸在痤瘡治療中抗炎作用的分子機制。

材料與方法

一、試劑和儀器

肽聚糖［美國Sigma公司，純度≥98%（高效液相色譜法測定）］來源于金黃色葡萄球菌細胞壁提取物，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成20 g/L混懸液，分裝后-20℃?zhèn)溆茫划惥SA酸［美國Sigma公司，貨號R3255，純度≥98%（高效液相色譜法測定）］，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成10-2mol/L，分裝后-20℃?zhèn)溆茫褂脮r用工作培養(yǎng)基調(diào)至所需濃度，控制DMSO濃度≤1‰（體積分數(shù)）。胰酶（美國Gibco公 司），Trizol RNA提 取 試 劑（美 國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本TaKaRa公司），實時熒光定量PCR試劑盒（美國BioRad公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢博士德公司），兔抗人TLR2、MyD88、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（美國CST公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（美國CST公司），BCA蛋白分析試劑盒（美國Thermo公司），化學發(fā)光試劑盒（美 國BioRad公 司）。ViiA7實 時PCR儀（Applied Biosystems?，美國Thermo公司），多功能酶標儀（美國BioTek公司）。

二、細胞培養(yǎng)

SZ95人皮脂腺細胞由德國Dessau臨床醫(yī)學中心皮膚科Zouboulis教授饋贈，將經(jīng)30～40次傳代的細胞用于實驗。用Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基（德國Biochrom公司）培養(yǎng)SZ95細胞，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素（均來自美國Gibco公司）、1 mmol/L CaCl2（美國Sigma公司）。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每兩天更換1次培養(yǎng)液。新鮮配制工作培養(yǎng)基。

三、實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α以及TLR2和MyD88 mRNA水平

將SZ95細胞接種于24孔板（1×105個/孔），培養(yǎng)24 h后分成3組，對照組不做處理，另外兩組分別用20 mg/L肽聚糖［6］單獨（肽聚糖組）或聯(lián)合10-5mol/L異維A酸［7］（共刺激組）共同處理。作用3 h后，胰酶消化收集細胞，用Trizol試劑提取總RNA，使用TaKaRa試劑盒按照說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，檢測基因及引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參照。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)45次，于60℃時收集數(shù)據(jù)。目的基因mRNA相對表達量以2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對照組。

四、ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α分泌量

將SZ95細胞接種于24孔板中（1×105個/孔），次日PBS清洗后，分組和處理同上，24 h后收集細胞上清液，4℃300×g離心后收集上清液分裝，-20℃保存。按照ELISA試劑盒說明書操作檢測，并設(shè)定空白對照孔，酶標儀檢測各孔450 nm處吸光度（A值）。根據(jù)標準曲線計算樣本濃度。

五、Western印跡檢測細胞中TLR2和MyD88蛋白水平

將SZ95細胞接種于6孔板中（1×106個/孔），24 h后待細胞融合度達到80%以上時，PBS清洗，分組和處理同上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，RIPA裂解液提取總蛋白，刮下細胞并轉(zhuǎn)移至1.5 ml微量離心管中，冰上裂解30 min，使蛋白充分裂解，10 000×g離心5 min，吸取上清液留存，棄沉淀。BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，封閉液封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入兔抗人TLR2、MyD88、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑盒顯影成像。

表1 實時熒光定量PCR檢測基因及引物序列（5′-3′）

六、數(shù)據(jù)處理

結(jié)果

一、異維A酸抑制肽聚糖誘導的SZ95細胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α mRNA表達

見表2。作用3 h后，對照組、肽聚糖組和共刺激組間IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α mRNA表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），肽聚糖組上述指標均高于對照組（均P＜0.016 7）和共刺激組（均P＜0.016 7）。

二、異維A酸對肽聚糖誘導的SZ95細胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α蛋白的影響

見表3。作用24 h后，對照組、肽聚糖組和共刺激組間上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α蛋白水平差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），肽聚糖組上述指標均高于對照組（均P＜0.0167）和共刺激組（均P＜0.016 7）。

三、異維A酸對肽聚糖誘導的SZ95細胞TLR2和MyD88 mRNA和蛋白表達的影響

見圖1。作用3 h后，對照組、肽聚糖組和共刺激組間MyD88 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（F=10.17，P＜0.01），肽聚糖組高于對照組（t=4.740，P＜0.016 7）和共刺激組（t=3.298，P＜0.0167）。作用48 h后，3組間MyD88蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義，肽聚糖組高于對照組和共刺激組。肽聚糖組TLR2 mRNA（t=7.071，P＜0.016 7）和蛋白表達水平均明顯高于對照組，而與共刺激組無顯著差異。

表2 異維A酸體外對肽聚糖誘導的SZ95人皮脂腺細胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達的影響（2-ΔΔCt）

表3 異維A酸體外對肽聚糖誘導的SZ95細胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白的影響（ng/L）

圖1 異維A酸對肽聚糖誘導的人皮脂腺細胞Toll樣受體2（TLR2）和MyD88 mRNA（1A、1B）和蛋白（1C）表達的影響a：P＜0.016 7

討論

研究顯示，痤瘡患者外周血單核細胞高表達TLR2［3-4］，且TLR2信號通路介導的天然免疫反應(yīng)在痤瘡發(fā)病中起重要作用。P.acnes通過激活角質(zhì)形成細胞及皮脂腺細胞中TLR2及其下游MyD88和核因子κB（NF-κB），誘導相關(guān)因子如IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等表達上調(diào)和釋放被認為是痤瘡發(fā)生發(fā)展的重要信號通路。炎癥發(fā)生與毛囊皮脂腺導管角化、皮脂腺脂質(zhì)分泌等也密切相關(guān)［8-9］。作為病原相關(guān)分子模式，肽聚糖是革蘭陽性細菌（包括P.acnes）細菌壁的主要成分，是細胞表面天然免疫分子TLR2的天然配體和激活劑［10］，常被用于體外痤瘡炎癥模型的刺激物。

異維A酸在皮脂腺細胞內(nèi)能特異性轉(zhuǎn)化為全反式維A酸，并蓄積在細胞內(nèi)作用于維A酸受體RAR（retinoic acid receptor）及RXR（retinoid X receptor），獨特的分子作用機制使其可以通過調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡而具有強大的抑制皮脂腺分泌活性［2］。異維A酸對痤瘡免疫和炎癥的調(diào)控作用是近年來藥物作用機制的研究熱點，研究顯示其可以抑制中性粒細胞遷移、溶酶體酶釋放、花生四烯酸代謝及白三烯和一氧化氮等炎癥介質(zhì)生成，并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、MMP-13及MMP-2的活性等［11］；痤瘡患者血清TNF-α、IL-4、IL-17和IFN-γ的基線水平顯著高于對照組，但在接受異維A酸治療后顯著降低［12］；異維A酸也被發(fā)現(xiàn)可以下調(diào)痤瘡患者外周血單核細胞TLR2的表達［13］。我們在肽聚糖誘導的人皮脂腺細胞炎癥模型上發(fā)現(xiàn)，異維A酸明顯下調(diào)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達，提示異維A酸對炎癥因子具有調(diào)控作用。

異維A酸可以抑制黑素瘤細胞中NF-κB p65、p50、c-Rel亞基和其他轉(zhuǎn)錄因子如c-fos、活化的轉(zhuǎn)錄因子2和環(huán)腺苷的活化和核轉(zhuǎn)位，從而抑制內(nèi)皮細胞遷移以及血管生成［14］。在小鼠肺泡癌Line 1細胞系中NF-κB的過度活化可以通過全反式維A酸過度激活RAR來抑制［15］。在小鼠脂肪細胞中，全反式維A酸的抗炎作用與NF-κB途徑中兩個亞基IκB和p65的磷酸化水平降低相關(guān)［16］。RXRα配體抑制NF-κB激活后TNF-α的表達，從而誘導MCF-7人乳腺癌細胞的凋亡［17］。全反式維A酸能誘導人胚胎癌細胞MyD88表達下調(diào)，而MyD88依賴TLR通路激活NF-κB［18］。全反式維A酸還能通過RARβ調(diào)節(jié)TLR4來改善大鼠和小鼠模型中腸上皮屏障功能［19］。前期研究證實肽聚糖誘導SZ95細胞MyD88表達增高［6］，我們進一步對相關(guān)信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，異維A酸對肽聚糖誘導的人皮脂腺細胞的TLR2表達沒有產(chǎn)生影響，但下調(diào)其下游關(guān)鍵基因MyD88的表達，提示異維A酸可能在皮脂腺細胞質(zhì)內(nèi)通過某種交聯(lián)直接作用于MyD88而非通過影響細胞膜上TLR2表達來發(fā)揮抗炎作用。由于異維A酸在細胞質(zhì)內(nèi)通過轉(zhuǎn)化為全反式維A酸作用于維A酸受體而發(fā)揮作用［7］，未來需要進一步研究異維A酸下調(diào)MyD88基因表達的機制。

總之，我們采用肽聚糖體外刺激人皮脂腺細胞構(gòu)建皮脂腺細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)肽聚糖明顯促進皮脂腺細胞分泌與痤瘡發(fā)病可能相關(guān)的炎癥因子，而異維A酸能夠顯著抑制肽聚糖誘導的這些炎癥因子mRNA和蛋白表達，并且抑制肽聚糖誘導的TLR2下游分子MyD88而非TLR2本身的表達。異維A酸抑制肽聚糖誘導的天然免疫反應(yīng)可能是其治療痤瘡的機制之一，進一步探索異維A酸如何作用于MyD88及其他相關(guān)炎癥基因并影響天然免疫信號通路有助于進一步揭示異維A酸的抗炎機制，指導臨床合理用藥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突