高糖環境下IQGAP1在足細胞中的表達及其對足細胞骨架重排的調節作用▲

黃 靜 張 璐 陳星華 楊英杰 李紫燃 程 暉

(武漢大學人民醫院腎內科，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：huang.jingkl@163.com)

糖尿病腎病是引起終末期腎衰竭的主要病因之一。腎小球臟層上皮細胞即足細胞，是腎小球濾過膜的最后一道屏障，其損傷對糖尿病腎病蛋白尿的發生與進展的影響日益受到重視[1]。足突融合是足細胞損傷的特征性微觀病理改變，其與足細胞骨架重排密切相關[2]。在正常足突中，細胞骨架蛋白纖維狀肌動蛋白(fibrous actin,F-actin)有序地平行聚集成束，形成應力纖維。病理狀態下，骨架發生重排，F-actin解聚或以松散的網狀機構互相結合。骨架重排是足突融合的共同通路[2]，是糖尿病腎病發生的關鍵環節之一。然而糖尿病腎病足細胞骨架重排的機制尚未明確。

IQ結構域GTP酶活化蛋白1(IQ domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)是一個含有多個蛋白結合域的支架蛋白。Schwarz等[3]的研究發現，IQGAP1蛋白在全身多個組織和細胞中表達，并在足細胞中大量表達。本課題組的前期研究顯示IQGAP1在嘌呤霉素誘導的足細胞骨架重排中發揮重要作用[4]。但IQGAP1是否參與糖尿病腎病的足細胞骨架重排尚未見報道。本課題旨在研究IQGAP1在高糖誘導的足細胞骨架重排中的作用及其可能的機制，進一步探討糖尿病腎病條件下足細胞損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清(美國Gibco公司，批號：1900-141)，1640培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WH01111810XP)，小鼠重組干擾素(美國PeproTech公司，批號：315-05)，細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013)，IQGAP1兔多克隆抗體(美國Santa Cruz公司，批號：sc-10792)，細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)兔多克隆抗體(美國Cell Signaling公司，批號：2462S)，β-肌動蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，批號：YSm-33036M)，鬼筆環肽(美國Sigma公司，批號：P5282)，X-tremeGENE轉染試劑(Roche公司，批號：6366244001)，免疫沉淀試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：P2012)。

1.2 細胞培養及分組 永生化小鼠足細胞株由美國紐約Peter Mundel教授惠贈。常規復蘇細胞后，用含10%胎牛血清、10 U/mL小鼠重組干擾素的1640培養基，置于33℃、5%CO2培養箱中進行增殖培養7～10 d，然后用含10%胎牛血清的無干擾素1640培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中分化培養10～14 d后用于后續實驗。細胞分組：(1)將細胞分為6組，分別加入不同濃度葡萄糖(5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)刺激48 h，然后檢測各組IQGAP1蛋白的表達情況；(2)另取細胞分為6組，加入高濃度葡萄糖(30 mmol/L)刺激不同時間(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)，然后檢測各組IQGAP1蛋白的表達情況；(3)另取細胞分為6組，包括正常糖濃度組(5 mmol/L葡萄糖，NG組)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖，HG組)、高滲對照組(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇，HO組)、HG+IQGAP1質粒轉染組、HG+空質粒轉染組、NG+IQGAP1質粒轉染組、NG+空質粒轉染組，每組均經葡萄糖刺激48 h，質粒轉染方法詳見1.3，干預后檢測各組IQGAP1蛋白或Cdc42蛋白表達情況。

1.3 質粒轉染IQGAP1 IQGAP1全長表達載體(pCantag-myc-IQGAP1質粒)由美國康奈爾大學Jon Erickson教授惠贈。取足細胞分別應用5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，將正常糖濃度組及高糖組足細胞接種于6孔板中(25 cm2/孔)培養至足細胞融合50%左右時進行轉染，將2 μg質粒與6 μL轉染試劑混勻，加入200 μL無血清1640培養基中，30 min后加入培養細胞，37℃恒溫培養箱中孵育48～72 h。空質粒轉染方法同上。

1.4 免疫印跡法檢測IQGAP1和Cdc42蛋白表達 細胞裂解液裂解NG組、NG+IQGAP1質粒轉染組、NG+空質粒轉染組、HG組、HG+IQGAP1質粒轉染組、HG+空質粒轉染組細胞，4℃ 2 500 r/min低溫離心5 min，后取上清，二喹啉甲酸BCA法測定蛋白濃度，100℃變性5 min，以20 μg/孔上樣，10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳，濕轉至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，一抗分別為IQGAP1兔多克隆抗體(1 ∶200)、Cdc42兔多克隆抗體(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，β-actin鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)作為內參。相應二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。應用Odyssey成像系統掃膜，Gel-Pro Analyzer凝膠定量分析軟件分析蛋白條帶吸光度值。

1.5 F-actin染色 將NG組、HG組、HO組、HG+IQGAP1質粒轉染組、HG+空質粒轉染組細胞分別培養于多聚賴氨酸涂層的蓋玻片上，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，4%多聚甲醛室溫固定15 min，Triton X-100穿透，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-鬼筆環肽(5 μg/mL)4℃孵育過夜，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染核，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，抗熒光淬滅甘油封片，熒光顯微鏡觀察細胞內F-actin分布。采用F-actin外周環評分(cortical F-actin score,CFS)評價F-actin分布情況：(1)F-actin形成正常應力纖維為0分；(2)F-actin外周環<1/2胞膜邊緣為1分；(3)F-actin外周環≥1/2胞膜邊緣為2分；(4)F-actin形成完整外周環為3分；每個視野計數100個細胞，取平均值。

1.6 免疫共沉淀分析 取NG組、HG組、HG+IQGAP1質粒轉染組、HG+空質粒轉染組細胞，按上海碧云天生物技術有限公司免疫沉淀標準操作流程進行實驗。裂解細胞收集蛋白后，加入2 μg IQGAP1兔多克隆抗體，4℃過夜，加入20 μL充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動3 h，2 500 r/min離心5 min，收集沉淀，加入40 μL 1×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，取樣品用于SDS-PAGE電泳，以免疫沉淀條帶中Cdc42與IQGAP1灰度值的比值評估Cdc42和IQGAP1的結合情況。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 葡萄糖刺激對足細胞IQGAP1蛋白表達的影響 (1)高糖刺激48 h后的足細胞IQGAP1蛋白表達水平低于高糖刺激0 h后(P<0.05)，見圖1及表1。(2)應用不同濃度葡萄糖刺激分化成熟的足細胞48 h，30 mmol/L葡萄糖刺激后足細胞的IQGAP1蛋白表達水平低于5 mmol/L葡萄糖刺激后的表達水平(P<0.05)，見圖2及表2。(3)葡萄糖刺激48 h后，NG組與HO組IQGAP1蛋白的表達情況差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3及表3。

2.2 高糖刺激對足細胞F-actin骨架分布的影響 NG組及HO組足細胞的F-actin聚集成束，呈微絲樣結構，延細胞長軸分布，形成應力纖維。刺激48 h后，HG組足細胞的F-actin排列紊亂，F-actin形成核外周環。HG組的CFS高于NG組(P<0.05)，HO組與NG組的CFS差異無統計學意義(P>0.05),見圖4及表4。

圖1 高糖刺激不同時間后足細胞IQGAP1蛋白的表達

圖2 不同濃度葡萄糖刺激48 h后足細胞IQGAP1蛋白的表達

圖3 NG組、HG組、HO組IQGAP1蛋白的表達情況

時間nIQGAP1相對表達水平0 h30.56±0.043 h30.55±0.026 h30.53±0.0212 h30.50±0.0124 h30.43±0.0248 h30.23±0.04? F值43.843P值<0.001

注：與0 h組比較，*P<0.05。

表2 不同濃度葡萄糖刺激48 h后足細胞IQGAP1蛋白的表達情況(x±s)

注：與5 mmol/L組比較，*P<0.05。

表3 NG組、HG組、HO組IQGAP1蛋白的表達情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05。

表4 NG組、HG組、HO組足細胞CFS比較(x±s，分)

注：與NG組比較，*P<0.05。

圖4 高糖刺激對足細胞F-actin骨架分布的影響(免疫熒光,×400)

2.3 IQGAP1質粒轉染對足細胞F-actin骨架分布的影響 FITC-鬼筆環肽染色結果顯示，NG組足細胞的F-actin聚集成束，呈微絲樣結構，沿細胞長軸分布，形成應力纖維；HG組足細胞的F-actin排列紊亂，F-actin形成核外周環；HG+IQGAP1質粒轉染組的足細胞骨架重排部分逆轉。HG+IQGAP1質粒轉染組的CSF低于HG組(P<0.05)，而HG+空質粒轉染組與HG組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5及表5。

圖5 IQGAP1質粒轉染對足細胞F-actin骨架分布的影響(免疫熒光，×400)

注：a為NG組；b為HG組；c為HG+IQGAP1質粒轉染組；d為HG+空質粒轉染組。

表5 4組轉染后足細胞的CSF比較(x±s，分)

注：與HG組比較，*P<0.05。

2.4 IQGAP1質粒轉染對足細胞IQGAP1及Cdc42蛋白表達的影響 (1)與NG組比較，NG+IQGAP1質粒轉染組的IQGAP1蛋白表達增加(P<0.05)，而NG+空質粒轉染組的IQGAP1蛋白表達與之差異無統計學意義(P>0.05)，提示IQGAP1質粒轉染成功。HG組的IQGAP1蛋白表達水平低于NG組(P<0.05)，而HG+IQGAP1質粒轉染組的IQGAP1蛋白表達水平高于HG組(P<0.05)。見圖6及表6。(2)HG組的Cdc42蛋白表達水平低于NG組(P<0.05)，而HG+IQGAP1質粒轉染組的Cdc42蛋白表達水平高于HG組(P<0.05)，HG組與HG+空質粒轉染組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6及表7。

圖6 IQGAP1質粒轉染后足細胞IQGAP1和Cdc42蛋白的表達情況

注：1、2、3、4、5、6分別為NG組、NG+IQGAP1質粒轉染組、NG+空質粒轉染組、HG組、HG+IQGAP1質粒轉染組、HG+空質粒轉染組。

表6 6組足細胞IQGAP1蛋白的表達情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

表7 6組足細胞Cdc42蛋白的表達情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

2.5 IQGAP1質粒轉染對IQGAP1和Cdc42相互作用的影響 與NG組比較，HG組的IQGAP1與Cdc42結合減少(P<0.05)；與HG組比較，HG+IQGAP1質粒轉染組的IQGAP1與Cdc42結合增加(P<0.05)；而HG+空質粒轉染組與HG組的IQGAP1與Cdc42的結合情況差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7及表8。

圖7 IQGAP1質粒轉染后IQGAP1和Cdc42的結合情況

注：1、2、3、4分別為NG組、HG組、HG+IQGAP1質粒轉染組、HG+空質粒轉染組。

表8 4組足細胞中IQGAP1與Cdc42的結合情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

3 討 論

足細胞病是一種由多種因素引起，以足細胞的結構和(或)功能損傷為主要特點的腎小球疾病[5]，主要表現為足突融合、凋亡或去分化增殖。足突融合是足細胞損傷的特征性微觀病理改變，見于多種腎小球疾病，如微小病變型腎病、糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等[6]。足突融合與足細胞骨架重排密切相關，其中足細胞骨架重排是足突融合的共同通路[2]。然而糖尿病腎病足細胞骨架重排的機制尚不明確。

IQGAP是一種含有多個蛋白結合域的支架蛋白家族，因含有類似RasGTPs催化域系列和4個可與鈣調蛋白相互作用的IQ基序而得名。IQGAP1是其中最重要且分布最廣泛的成員，含有肌動蛋白結合區、細胞外調節蛋白激酶Ⅱ蛋白結合區、Rho鳥苷三磷酸酶(Rho-guanosine triphosphatase，Rho GTPase)結合區及鈣調蛋白結合區[7]。既往研究表明IQGAP1在細胞骨架的調節中發揮重要作用，其可通過調節細胞骨架重排來調節細胞黏附、遷移和極化[8-11]。本課題組的前期研究結果表明IQGAP1參與嘌呤霉素誘導的足細胞骨架重排[4]。但關于IQGAP1在糖尿病腎病領域的研究卻很少。本研究結果顯示，HG組足細胞的F-actin排列紊亂，F-actin形成核外周環，且其CFS高于NG組(P<0.05)，而HO組與NG組的CFS無差異(P>0.05)，這提示高糖刺激可引起足細胞骨架重排；高糖(30 mmol/L)刺激后足細胞的IQGAP1蛋白表達水平低于正常濃度(5 mmol/L)葡萄糖刺激后的水平(P<0.05)，且高糖刺激48 h后的足細胞IQGAP1蛋白表達水平低于高糖刺激0 h后的水平(P<0.05)，提示高糖刺激可下調足細胞的IQGAP1蛋白表達，并在一定程度上呈時間及濃度依賴。此外，HG+IQGAP1質粒轉染組的IQGAP1蛋白表達水平高于HG組(P<0.05)，提示IQGAP1轉染可逆轉高糖刺激引起的IQGAP1表達減少；HG+IQGAP1質粒轉染組的足細胞骨架重排部分逆轉，且其CSF低于HG組(P<0.05)，提示上調足細胞IQGAP1蛋白表達后，高糖誘導的足細胞骨架重排改善。以上結果說明IQGAP1蛋白可能參與糖尿病環境中的足細胞骨架重排，我們推測支架蛋白IQGAP1可能通過與某一蛋白結合發揮調節作用。

既往有學者認為，IQGAP1對細胞骨架的調節與Rho GTPase有關，IQGAP1含有可與Rho GTPase家族結合的區域，可通過與Rho GTPase結合調節骨架重排[8-10，12]。Rho GTPase在肌動蛋白細胞骨架調節中發揮著關鍵作用，目前研究得最多的成員是Cdc42、Rac1、Rho[13]。Cdc42通過誘導肌動蛋白聚合，在足細胞骨架重排中發揮重要作用，研究證實敲除足細胞中Cdc42的編碼基因，可抑制肌動蛋白向腎小球足細胞特異性蛋白—nephrin聚集位點集聚，從而導致先天性腎病綜合征的發生[14]。有學者對淋巴細胞和神經細胞進行研究發現，IQGAP1、Cdc42、肌鈣蛋白可結合形成三聯體，發生免疫共沉淀[15-16]。本研究結果顯示，HG組的Cdc42蛋白表達水平低于NG組(P<0.05)，提示高糖刺激不僅可誘導足細胞IQGAP1蛋白表達減少和足細胞骨架重排，還可下調Cdc42表達。本研究中的免疫共沉淀結果顯示，與NG組比較，HG組的IQGAP1與Cdc42結合減少(P<0.05)，與HG組比較，HG+IQGAP1質粒轉染組的IQGAP1與Cdc42結合增加(P<0.05)，提示在高糖條件下小鼠足細胞IQGAP1與Cdc42結合減少，而通過質粒轉染增強IQGAP1的表達后，可增加二者的結合，從而改善高糖誘導的足細胞骨架重排。

綜上所述，高糖環境可誘導足細胞骨架重排，并減少IQGAP1及Cdc42蛋白表達以及IQGAP1與Cdc42的結合，而IQGAP1可能通過與Cdc42結合而調節細胞骨架重排。IQGAP1/Cdc42結合途徑可為糖尿病腎病的防治提供一個新的治療靶點。