丙戊茶堿對趾部切口痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化的影響

金 旭 石翊颯 張 東 武琰嬌

（1蘭州大學第二臨床醫學院麻醉醫學系，蘭州 730000；2蘭州大學第二醫院麻醉科，蘭州 730030）

術后疼痛是指手術后即刻發生的急性疼痛，持續時間通常不超過7天，但控制不佳可發展為慢性疼痛綜合征，不僅造成病人身心損傷，而且增加家庭和社會的經濟負擔。藥物治療是治療術后急性疼痛的最主要方法，但現有鎮痛藥物（非甾體類、阿片類等）在緩解疼痛的同時多伴有相關副作用。多種鎮痛藥物及輔助藥物聯合應用的多模式鎮痛新思路為此提供了解決方案，因此新型鎮痛藥物的研發及疼痛治療新靶點的研究的重要性不言而喻。近年來，神經膠質細胞在急性疼痛向慢性疼痛轉化及慢性疼痛維持過程中的作用逐漸得到重視[1～3]，并且神經膠質細胞活化抑制劑丙戊茶堿已被證實在切口痛[4～6]、神經病理性痛[7]、炎性痛[8]中發揮鎮痛作用，但其作用機制尚不知曉。

ERK1/2是真核細胞內重要的信號傳導激酶，與c-jun氨基末端激酶和p38激酶同屬于絲裂原活化蛋白激酶家族。研究表明ERK1/2磷酸化后可調節神經元興奮性，參與脊髓痛覺信號調制，是引起慢性疼痛過敏的關鍵因素，抑制其活化能緩解疼痛[9,10]，但是脊髓ERK1/2在急性疼痛過程中的作用機制尚未完全明確，其細胞定位尚未見報道。我們課題小組在趾部切口痛模型大鼠的前期研究中發現，丙戊茶堿能通過抑制脊髓c-jun氨基末端激酶[4]和p38激酶[6]活化來提高大鼠對機械刺激和熱刺激的疼痛閾值，由此假設丙戊茶堿可能通過抑制脊髓ERK1/2活化來緩解術后急性痛覺過敏。

本研究采用趾部切口痛(incisional pain,IP)模型觀察鞘內注射丙戊茶堿對切口痛大鼠機械痛閾、熱痛閾和p-ERK1/2表達的影響，同時檢測脊髓p-ERK1/2的細胞定位，探討丙戊茶堿緩解術后急性痛覺過敏的可能分子機制，為新型鎮痛藥物研發提供基礎理論依據。

方 法

1.實驗材料

（1）實驗動物

清潔級雄性SD大鼠100只，體重200～250 g，由蘭州大學基礎醫學院動物實驗中心提供。所有實驗操作遵循國際疼痛學會相關指南，并且通過蘭州大學第二醫院倫理委員會審核批準。

（2）試劑、儀器

丙戊茶堿（美國Sigma），p-ERK1/2（美國Cell Signaling Technology），t-ERK1/2（美國Proteintech），GAPDH（北京Solarbio），NeuN（美國Abcam），GFAP（武漢博士德），Iba-1（美國Proteintech）等。Plantar Test（意大利UGO BASILE，37370），Von Frey纖維絲（美國North Coast Medical），冰凍切片機（德國Leica，CM1950），熒光顯微鏡（日本OLYMPUS，BX51），電泳儀（美國BIO-RAD）等。

2.實驗方法

（1）實驗分組及給藥

清潔級雄性SD大鼠100只按隨機數字表法分為4組，每組25只，分別為空白對照組（C組）；切口痛模型組（IP組）；生理鹽水組（NS組）；丙戊茶堿組（PPF組）。IP組、NS組和PPF組均制備左后肢趾部切口痛模型；NS組和PPF組分別于術前30 min鞘內注射NS 10 μl和PPF 10 μg/10 μl，C組和IP組不作鞘內注射。

（2）趾部切口模型制備

按照Brennan方法[11]制備趾部切口痛模型：大鼠乙醚吸入麻醉，消毒左后肢趾部，自左后足跟0.5 cm處向趾端作約1 cm長的縱行切口；切開皮膚和筋膜后，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割一次，注意保持肌肉附著完整并不損傷血管和神經；切割完成后輕壓止血，用3-0絲線縫合皮膚兩針，再次消毒皮膚，單籠飼養。手術用時約3 min。為保持一致性，所有模型制備均由同一人完成。

（3）行為學測定

各組分別在術前、術后2、4、8、24、72 h隨機抽?。ǔ楹灧ǎ?0只大鼠進行MWT和TWL測定。MWT：按照Dixon建立的“up and down”方法[12]進行測定。將大鼠單獨放入底部為金屬網格的有機玻璃箱內適應10～15 min后，用Von Frey纖維絲垂直刺激切口旁皮膚6～8 s，刺激間隔至少30 s，若5次刺激出現3次快速縮足或舔足反應記為疼痛X，給予低一級強度刺激，反之記為O，給予高一級強度刺激。初始刺激強度為2.0 g，刺激強度范圍為0.4～15 g，超出范圍直接記為15 g或0.4 g。當出現反應不同時再依序測量4次，共得到一組6個字符的數據（除XXXXX和OOOOOO外），將最末刺激強度代入公式計算得到MWT。MWT值越低，表示大鼠對機械刺激的痛覺過敏越嚴重。TWL：按照Hargreaves方法[13]進行測定。在無日光直射環境中，將大鼠單獨放入底部透明的有機玻璃箱內適應10～15 min后，用熱輻射刺激儀熱源垂直照射切口旁皮膚，記錄照射開始至大鼠抬足時間，終止時間為30 s，測定時保持刺激強度相同。重復測定3次，每次間隔至少5 min，取3次平均值為TWL。TWL值越低，表示大鼠對熱刺激的痛覺過敏越嚴重。測定時需保持環境安靜。

（4）蛋白印跡分析

各組于術前、術后2、4、24、72 h行為學測定完畢后隨機選取3只大鼠，行頸椎脫臼處死后立即取出脊髓L4-6節段，稱重后冰上裂解30 min；12 000 rpm離心20 min，取上清液加入1/3體積上樣緩沖液，煮沸5 min后得到蛋白樣品。上樣電泳，濕轉法轉膜；5%脫脂奶粉（含5%胎牛血清）室溫封閉2 h，一抗(p-ERK1/2,1:1 000; t-ERK1/2,1:3 000; GAPDH,1:2 000) 4℃震蕩孵育過夜；次日于室溫震蕩復溫后TBST洗3次，每次10 min；二抗（辣根素過氧化物酶標記，1:5 000）室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；暗室內滴加ECL發光液發光，膠片顯影。使用Image J軟件測定免疫蛋白印跡條帶平均光密度值，p-ERK1/2與t-ERK1/2比值為p-ERK1/2相對表達量，t-ERK1/2與GAPDH比值為t-ERK1/2相對表達量。

（5）免疫熒光染色法

各組于術后p-ERK1/2表達量最高時（參照免疫印跡分析結果）隨機選取3只大鼠，腹腔內注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，立即暴露心臟并經心尖穿刺插管至升主動脈，順序灌注預冷生理鹽水和4%多聚甲醛，暴露并切取脊髓L4-6節段，浸入4%多聚甲醛后固定過夜，再依次浸入20%、30%蔗糖溶液梯度脫水至沉底，冰凍切片，每片厚10 μm。熒光染色法（漂片法）：PBS (0.01 M，pH7.4)洗片3次，每次10 min；10%山羊血清室溫封閉2 h，加一抗p-ERK1/2 (1:100) 4℃過夜；次日室溫復溫后PBS洗3次，每次10 min，加入RBITC標記(1:400)熒光二抗，室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次10 min，抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像。熒光雙染法：一抗加入p-ERK1/2 (1:100)和NeuN (1:100)或GFAP (1:1 000)或Iba-1 (1:100)，二抗加入RBITC標記（1:400)和Alexa Fluor 488 (1:400)標記熒光二抗，其余步驟同熒光染色法，置于熒光顯微鏡觀察并拍攝相同視野下不同波長圖像，使用Image J軟件進行圖像融合。

3.統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料表示采用均數±標準差(±SD)，行為學比較采用雙因素重復測量方差分析(Two-way repeated measures,ANOVA)和t檢驗(Student'sttest)，Western blot結果采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.丙戊茶堿對切口痛大鼠機械痛閾和熱痛閾的影響

各組大鼠術前MWT差異無統計學意義；與術前比較，C組術后各時間點MWT差異無統計學意義；與C組比較，IP組和NS組術后各時間點MWT均明顯降低(P＜0.001)，PPF組術后2、4、8、24 h的MWT明顯降低(P＜0.001)，術后72 h的MWT差異無統計學意義；與IP組比較，NS組術后各時間點MWT差異無統計學意義，PPF組術后2 h (P＜0.001)、4 h (P＜0.001)、8 h (P＜0.001)、24 h (P＜0.001)、72 h (P＜0.01) MWT明顯升高；與NS組比較，PPF組術后各時間點MWT均明顯升高（P＜0.001，見表1）。

各組大鼠術前TWL差異無統計學意義；與術前比較，C組術后各時間點TWL差異無統計學意義；與C組比較，IP組、NS組和PPF組術后各時間點TWL均明顯降低(P＜0.001)；與IP組比較，NS組術后各時間點TWL差異無統計學意義，PPF組術后各時間點TWL均升高(P＜0.001)；與NS組比較，PPF組術后各時間點TWL均升高（P＜0.001，見表2）。

2.丙戊茶堿對切口痛大鼠脊髓p-ERK1/2和t-ERK1/2表達的影響

各組大鼠術前p-ERK1/2表達量差異無統計學意義；與術前比較，C組術后各時間點p-ERK1/2表達量差異無統計學意義；與C組比較，IP組術后2 h (P＜0.01)、4 h (P＜0.001)、24 h (P＜0.05) p-ERK1/2表達增加，術后72 h表達減少(P＜0.01)；與IP組比較，NS組術后各時間點p-ERK1/2表達量差異無統計學意義；與IP組比較，PPF組術后2、4、24 h的p-ERK1/2表達減少(P＜0.01)，術后72 h表達量差異無統計學意義；與NS組比較，PPF組術后2、4、24 h的p-ERK1/2表達減少(P＜0.01)，術后72 h表達量差異無統計學意義（見圖1A）。

與C組比較，各組各時間點t-ERK1/2表達量差異無統計學意義（見圖1B）。

3.趾部切口痛大鼠脊髓p-ERK1/2表達、細胞定位及丙戊茶堿的影響

蛋白印跡分析結果顯示大鼠脊髓p-ERK1/2于術后4 h表達量最多，此時應用免疫熒光法顯示p-ERK1/2主要表達于脊髓背角淺層（見圖2）。免疫熒光雙染結果顯示p-ERK1/2與神經元標記物NeuN、星型膠質細胞標記物GFAP和小膠質細胞標記物Iba-1共表達（見圖3）。

表1 各組大鼠不同時間點MWT的變化(n = 10,±SD)Table1 The change of MWT at different time points in each group (n = 10,±SD)

表1 各組大鼠不同時間點MWT的變化(n = 10,±SD)Table1 The change of MWT at different time points in each group (n = 10,±SD)

*P＜0.001，與C組比較；#P＜0.01，與IP組比較；△P＜0.001，與NS組比較*P＜0.001,compared with group C; #P＜0.01,compared with group IP; △P＜0.001,compared with group NS.

組別Group 13.16±1.11 13.39±1.1013.12±1.2613.34±1.1513.17±1.2213.03±1.12 IP13.34±1.30 1.94±0.90* 0.66±0.31* 2.14±0.74* 4.11±0.97* 9.39±0.63*NS12.81±0.99 2.09±0.62* 0.85±0.37* 2.09±0.69* 4.19±0.78* 9.13±0.91*PPF13.30±1.19 3.93±0.50*#△ 2.98±0.63*#△3.76±0.65*#△ 7.19±1.05*#△ 11.63±1.45#△基礎閾值(g)Baseline術后機械縮足閾MWT after operation (g)2 h4 h8 h24 h72 h C

表2 各組大鼠不同時間點TWL的變化 (n = 10,±SD)Table2 The change of TWL at different time points in each group (n = 10,±SD)

表2 各組大鼠不同時間點TWL的變化 (n = 10,±SD)Table2 The change of TWL at different time points in each group (n = 10,±SD)

*P＜0.001，與C組比較；#P＜0.001，與IP組比較；△P＜0.001，與NS組比較*P＜0.001,compared with group C; #P＜0.001,compared with group IP; △P＜0.001,compared with group NS.

組別Group 25.68±1.7325.19±1.5425.15±1.3925.13±1.6124.68±1.1925.41±1.51 IP25.10±1.04 6.33±0.95* 4.37±0.89* 6.20±0.79* 8.07±1.01*18.25±1.30*NS25.96±0.90 7.00±0.71* 4.36±0.95* 6.17±0.78* 8.23±0.77*18.82±1.00*PPF25.40±1.4312.03±1.11*#△ 8.31±0.83*#△11.46±1.23*#△15.31±1.04*#△23.07±1.08*#△基礎閾值(s)Baseline術后熱縮足潛伏期TWL after operation (s)2 h4 h8 h24 h72 h C

圖1 丙戊茶堿對大鼠不同時間點p-ERK1/2和t-ERK1/2表達的影響(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，與C組比較；##P ＜ 0.01，與IP組比較；△△P ＜ 0.01，與NS組比較Fig.1 Effect of PPF on expression of p-ERK1/2 and t-ERK1/2 at different time points (n = 3,±SD)*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001,compared with group C; ##P ＜ 0.01,compared with group IP; △△P ＜ 0.01,compared with group NS.

討 論

研究采用Brennan建立的大鼠趾部切口痛模型，操作過程簡單、可重復性高，是目前研究術后急性疼痛的經典模型之一。本實驗中大鼠表現為切割側后爪不負重或懸空，?？s攏并緊貼于下腹部，行走時步態呈跛行；與C組比較，IP組大鼠術后各時間點MWT和TWL均明顯降低，這與文獻報道[11]及本課題組早期研究結果[4～6]一致，提示模型制備成功。同時通過在實驗中比較NS組和IP組，排除鞘內注射操作和丙戊茶堿溶媒（生理鹽水）對行為學測定和免疫學檢測的干擾。

圖2 術后4 h各組大鼠脊髓p-ERK1/2表達Fig.2 Expression of p-ERK1/2 in spinal cord of rats in each group at 4 h after operation

圖3 術后4 h大鼠脊髓p-ERK1/2表達定位Fig.3 Location of p-ERK1/2 in spinal cord of rats at 4 h after operation

丙戊茶堿是甲基黃嘌呤衍生物，可通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活化來抑制膠質細胞活化[14]，繼而影響膠質細胞內受體、離子通道的調節并抑制多種促炎細胞因子的釋放[5,15]。本實驗中丙戊茶堿使用劑量參照文獻[4]，即10 μg于術前30 min鞘內注射。結果顯示PPF組大鼠MWT和TWL較IP組均明顯延長，并且術后72 h與C組比較無顯著差異，說明鞘內注射丙戊茶堿可緩解大鼠在切口痛急性期的機械痛敏和熱痛敏，其機制可能是丙戊茶堿抑制星型膠質細胞和小膠質細胞并下調P物質、腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β釋放[5]，減少上述促炎細胞因子在脊髓局部的刺激作用，降低神經元興奮性，緩解由趾部切割引起的急性痛覺過敏。

真核細胞內ERK1/2能被多種細胞外刺激信號激活，通過轉錄或非轉錄方式調節突觸后膜上多種受體和離子通道的功能，改變突觸可塑性，在多種疼痛的產生和維持過程起重要作用[9,10]。趾部切割后IP組大鼠脊髓p-ERK1/2表達量及陽性細胞數目均增加，提示p-ERK1/2與痛敏相關，參與大鼠切口痛的調制過程。對脊髓p-ERK1/2表達時程進行分析，發現術后4 h達到高峰；術后24 h量降低，但仍高于C組；術后72 h低于C組。提示p-ERK1/2主要在切口痛的產生過程中發揮作用，而在疼痛維持過程中作用有限，推測機制與p-ERK1/2參與的非轉錄調節有關。p-ERK1/2能促進NMDA受體和AMPA受體磷酸化并招募AMPA受體的GluR1亞單位插入突觸后膜，增強突觸轉運功能，細胞Ca2+內流增加，神經元興奮性升高；p-ERK1/2參與Kv4.2鉀離子通道的調制，抑制A型鉀離子外向電流，突觸后膜興奮閾值降低，對外周傳入刺激反應性增強[9,10]。鞘內注射丙戊茶堿后p-ERK1/2在術后2、4、24 h表達降低，提示丙戊茶堿在切口痛急性期的鎮痛作用至少部分通過抑制脊髓ERK1/2活化來實現。免疫熒光雙染結果分析發現C組大鼠脊髓p-ERK1/2僅在神經元少量表達，而術后4 h時p-ERK1/2在脊髓背角淺層顯著活化并分布于神經元、星型膠質細胞和小膠質細胞，進一步證實p-ERK1/2在切口痛的調制過程的重要性和復雜性，而因其作用受到影響的不同類型細胞的膜受體、離子通道或激酶類型還有待進一步研究。

綜上所述，大鼠趾部切割后機械痛閾及熱痛閾明顯降低，脊髓背角淺層神經元、星型膠質細胞和小膠質細胞內p-ERK1/2表達上調，而鞘內注射丙戊茶堿可抑制p-ERK1/2表達，同時顯著提高大鼠機械痛閾和熱痛閾，提示丙戊茶堿能通過下調脊髓背角p-ERK1/2表達來緩解切口痛大鼠急性痛覺過敏，其深入機制有待使用特異性抑制劑、基因敲除或RNA干擾等特異性技術進一步研究。