桂林地區致仔豬腹瀉大腸桿菌血清型鑒定與耐藥性分析

李勁松，唐建華，向陽鴻

(1.桂林市動物疫病預防控制中心，廣西桂林541001 ； 2.西南大學動物科學學院 ，重慶榮昌402460 ； 3.重慶方通動物藥業有限公司，重慶榮昌402460)

近幾年，仔豬的腹瀉病成為臨床中常見的疾病之一，主要由傳染性病原感染以及非傳染性因素等引起，傳染性因素包括細菌、病毒以及其他病原的感染，其中細菌引起的仔豬腹瀉在仔豬感染性腹瀉中占有較大比重，尤其致病性大腸桿菌和沙門菌引起的仔豬腹瀉臨床中最為常見，其感染率和死亡率均較高，給養殖戶造成嚴重的經濟損失。致病性大腸桿菌可以引起家畜、家禽等多種動物及人發病，為重要的人獸共患病原菌。仔豬大腸桿菌病是由某些致病性血清型大腸桿菌引起仔豬腹瀉的一類傳染性疾病的總稱，根據其致病性大腸桿菌的病原類型、臨床癥狀表現、病理剖檢及流行病學特征的不同，可以分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，其中，臨床上以仔豬黃白痢發病率和死亡率較高，給養豬業造成了巨大的經濟損失，嚴重影響我國養豬業的發展[1-2]。由于大腸桿菌血清型眾多，給疫苗的研制帶來很大困難，抗生素成為防治大腸桿菌主要手段，在養豬的過程中抗生素不合理的使用，產生很強的耐藥性，降低了治療效果，同時造成豬肉等畜產品中嚴重的藥物殘留，威脅人類的健康，應引起重視[3]。

本試驗從桂林地區不同養豬場中，采集患腹瀉仔豬肝臟、肛拭子及糞便等病料組織，共分離到67株大腸桿菌，對分離的67株大腸桿菌的致病性、血清型及耐藥性進行分析，為該地區的仔豬腹瀉性大腸桿菌病的防治提供參考依據。

1 材料

1.1 病料來源 桂林地區不同養豬場無菌采集的患腹瀉病仔豬肝臟、肛拭子及糞便等病料組織樣品103份。

1.2 試劑與儀器 麥康凱培養基、伊紅美藍培養基、MH培養基、營養肉湯培養基，均購自北京陸橋生物技術有限責任公司；革蘭染色試劑盒購自青島高科園海博生物技術有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司；E.coli標準O型血清因子購自中國獸醫藥品監察所；ID32E腸桿科菌鑒定試劑條購自法國梅里埃生物技術公司； ATB自動生化鑒定系統儀由法國梅里埃生物技術公司生產；恒溫培養箱由上海經濟區沈蕩中新電器有限公司生產；多功能梯度 PCR儀(VeritiTm 96-Well Thermal型)由美國 ABI 公司生產；常規的儀器及試劑均由桂林市動物疫病預防控制中心實驗室以及重慶方通動物藥業有限公司提供。

1.3 實驗動物 (25±2)g昆明系小鼠340只，購自重慶方通動物藥業有限公司。

2 方法

2.1 細菌的分離培養 無菌采集的患病仔豬肝臟、肛拭子和糞便等病料組織樣品103份接種麥康凱培養基上，置37 ℃培養箱中培養12-18 h，選取單個優勢菌落接種于鑒別培養基伊紅美藍平板上培養，挑取伊紅美藍培養基上的單個菌落接種于營養肉湯中進行純化培養， 37 ℃搖床震蕩培養12 h后，革蘭染色觀察分離菌株的形態學。

2.2 細菌生化試驗鑒定 按照ID32E腸桿科菌鑒定試劑條說明書，將純化培養后的分離菌株通過比色法調整菌液濃度為0.5麥氏濁度，加入ID32E腸道菌鑒定試條中 37 ℃培養12-24 h，用ATB自動生化鑒定系統儀對分離菌株進行生化試驗鑒定。

2.3 細菌PCR鑒定及測序 參考文獻[4]，設計細菌的16S rRNA基因序列通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，由華大生物工程有限公司合成。用水煮法制備分離菌株的基因組DNA模板，對分離菌株進行PCR鑒定。 PCR增反應體系(50 μL)：2×TaqMarker Mix 25 μL，引物P1、P2各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃終延伸10 min，共30個循環。用1%瓊脂糖檢測分離菌株的目的條帶后，將分離菌株的PCR擴增產物送華大生物工程有限公司測序，測序結果與GenBank中登錄的基因序列進行同源性比較。

2.4 致病性試驗 將分離菌株培養至對數期，調整菌液濃度為108CFU/mL；每1株分離菌株攻毒5只小鼠，每只小鼠通過灌胃的方式攻毒，劑量為0.25 mL(108CFU/mL)，空白對照組用同樣方法給予等量的營養肉湯；腹腔注射等量的滅菌的生理鹽水。在攻毒12 h后，觀察7 d，記錄每個試驗組小鼠的發病及死亡情況，并對于死亡的小鼠進行細菌分離鑒定。

2.5 分離株血清型鑒定 參考文獻[5]，用E.coli標準O型血清因子進行玻片凝集試驗檢測致病性大腸桿菌的血清型。

2.6 分離菌株的藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行操作，結果判斷。

3 結果

3.1 細菌的分離鑒定結果 在麥康凱瓊脂培養基上長出邊緣光滑整齊的、濕潤的、粉紅色扁圓的菌落；在伊紅美蘭培養基上長出深紫黑色或者褐色并帶金屬光澤、圓形菌落；革蘭染色為陰性、兩端鈍圓的桿狀菌。與報道的大腸桿菌培養特性和形態學一致。通過統計103份樣品中67株分離菌株疑似大腸桿菌。

3.2 細菌生化鑒定結果 分離菌株V-P試驗為均陰性、吲哚試驗均為陽性，能發酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，產酸不產氣；將培養的ID32E腸桿科菌鑒定試劑條放入ATB全自動生化鑒定系統進行生化鑒定分析，結果顯示，67株分離菌株均鑒定為大腸桿菌，系統評定合格率在98.9%～99.9%之間。67株分離菌株生化特性與報道的大腸桿菌的生化特性一致。

3.3 細菌的PCR鑒定結果 用細菌的16S rRNA基因序列通用引物對分離菌株進行了PCR鑒定，67株分離菌株均擴增出大約為1 492 bp左右的目的基因的條帶(見圖1)。67分離菌株測序結果后與GenBank中登錄的參考株大腸桿菌的基因序列同源性在98.9%～99.9%之間，因而證實了67株分離菌株為大腸桿菌。

圖1 部分分離菌株PCR鑒定結果

M:DL-2 000 Marker ; 1-7:分離菌株

3.4 致病性試驗結果 試驗組攻毒的小鼠在攻毒后的48-72 h出現不同程度的死亡，在死亡的小鼠肝臟組織中分離到大腸桿菌。直到試驗結束(7 d)，對照組5只小鼠未出現明顯的變化。通過致病試驗統計與分析，67株分離菌中52株大腸桿菌分離株對小鼠致死率為100%，為致病性大腸桿菌。

3.5 血清型檢測結果 結果見表1。52株仔豬致病性大腸桿菌分離株共包括屬于12個血清型，定型菌株為52株，占分離菌株的77.6%(52/67)；其中，以O149、O109和O9為流行的優勢血清型，分別占仔豬致病性分離菌株的21.2%、15.4%、13.5%和11.5%。

表1 52株致仔豬腹瀉性大腸桿菌血清型檢測結果

3.6 耐藥性分析結果 結果見表2。52株仔豬致病性大腸桿菌分離株存在著嚴重的耐藥性，呈現多重耐藥。對阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素3種藥物的耐藥率最高，高達100%；對環丙沙星、恩諾沙星、氨芐西林3種藥物的耐藥率在88.4%～98.1%之間；對阿米卡星、林可霉素、慶大霉素、多粘菌素、強力霉素、大觀霉素6種藥物的耐藥率在51.9%～75.0%之間；對頭孢克肟、頭孢他啶、氟苯尼考3種藥物耐藥性在23.1%～48.1%之間。

表2 52株致仔豬腹瀉性大腸桿菌耐藥性分析結果

4 討論

仔豬大腸桿菌病為養豬過程中常見的細菌性傳染病之一，該病可以引起仔豬嚴重腹瀉，導致仔豬嚴重生長發育受阻，增重緩慢，臨床中引起仔豬黃白痢大腸桿菌主要是腸毒素性大腸桿菌(ETEC)，感染率和死亡率較高，嚴重影響著養豬業發展[6]。近幾年，關于致病性大腸桿菌引起仔豬腹瀉的報道越來越多，應引起重視。本試驗從桂林地區不同的養殖場中，采集了103份患腹瀉仔豬肝臟、肛拭子和糞便等病料組織樣品中分離到了52株致病性大腸桿菌，從而證實了桂林地區不同的養殖場中致仔豬腹瀉性大腸桿菌廣泛流行，應引起重視并進行合理的防治。

由于大腸桿菌血清型眾多，具有多樣流行性，不同血清型間菌株之間缺乏有效的交叉免疫保護性，目前沒有理想疫苗對該病進行預防[5]。因此，導致仔豬致病性大腸桿菌流行。本試驗分離的52株仔豬致病性大腸桿菌屬于12個血清型，其中，以O149、O109和O9為流行的優勢血清型。從而證實該地區仔豬致病性大腸桿菌流行的血清型復雜，具有多樣性。吳利軍等[6]報道了湖北地區規模化養殖場中仔豬腹瀉性大腸桿菌的流行血清型以O4、O55、O119為主。孫曉鍇[7]報道了重慶地區的仔豬源大腸桿菌流行的血清型為O101、O8、O20、O64、O45、O149。王鵬等[8]報道了四川地區豬水腫病致病性大腸桿菌以O139主要的流行血清型。仔豬腹瀉性大腸桿菌的流行血清型與地區有關，不同地區分離的大腸桿菌流行的血清型也不同，其致病性也存在一定的差異性。

大腸桿菌具有易產生耐藥性的特點，由于抗生素的不合理的使用，造成嚴重的耐藥性，且耐藥譜型不斷的增大。本試驗耐藥性分析結果表明，52株仔豬致病性大腸桿菌分離株存在著嚴重的耐藥性，呈現多重耐藥。對阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素3種藥物的耐藥率高達100%；對環丙沙星、恩諾沙星、氨芐西林3種藥物的耐藥率在88.4%～98.1%之間；對其他藥物耐藥率在在51.9%～75.0%之間；對頭孢克肟、頭孢他啶、氟苯尼考3種藥物耐藥性相對較低，在23.1%～48.1%之間。與吳利軍等[6]、郭瀟木等[9]、馬長賓等[10]的報道存在一定差異性，可能與地區流行的致病性大腸桿菌有關，還可能與用藥情況有關。因此，當仔豬發生該病時，應進行藥敏試驗，合理使用藥物預防與治療，提高治療效果，同時要加強平時的飼養管理。