豬圓環病毒3型PCR檢測方法的建立及其分子流行病學調查

楊 斌，黃紅亮，吳玉全，廖翠銀，方倪冉，王志偉，陳瑞愛,

(1.華南農業大學獸醫學院，廣東廣州510642 ； 2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東新興527400)

豬圓環病毒(PCV)屬于圓環病毒科、圓環病毒屬，是一種無囊膜、共價閉合的單股環狀DNA病毒，也是目前已知最小的動物DNA病毒。豬圓環病毒目前主要由PCV1、PCV2和PCV3組成。PCV2主要包含2個開放性閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼復制酶(Rep)和衣殼蛋白(Cap)，ORF1是最大的ORF，編碼296aa的Rep蛋白，ORF2編碼的Cap蛋白是PCV唯一的結構蛋白和主要抗原[1-3]，臨床上主要表現為感染的仔豬消瘦、關節腫脹、呼吸系統疾病和母豬繁殖障礙等[4-5]。2015年PCV3在美國首次被發現，隨后在北美，亞洲，歐洲等3個大洲多個國家被檢出患病豬只的組織中含有PCV3[6]。目前，PCV3已經成為造成養豬業損失的重要病因之一，并且還有加劇的趨勢。可見，及時掌握我國PCV3的流行狀況及建立快速，準確，簡單有效的檢測方法迫在眉睫，本實驗室建立了一種簡單、特異、靈敏的PCR檢測方法，同時利用該方法對我國14個省市的病豬樣品進行檢測并測序，通過同源性分析，為預防和控制PCV3的流行傳播奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 樣品主要采集自河南、陜西、江西、廣西、四川、重慶等14個省(市)的90多個大型豬場的322份疑似感染病料。

1.1.2 毒株 豬瘟病毒毒株(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株(PRRSV)、豬圓環病毒2型病毒毒株(PCV2)、豬偽狂犬病病毒株(PRV)由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 DNA抽提試劑盒購自康寧生命科學(吳江)有限公司，TAE 緩沖液(Tris-acetate-EDTA)購自上海百賽生物技術有限公司，PCR試劑盒、質粒回收試劑盒、膠回收試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據豬圓環病毒3型分離株 PCV3-Hebei-LY_2015(GenBank 登錄號：MF318451.1)設計了特異性鑒定引物及Cap蛋白基因序列引物，由上海英濰捷基貿易有限公司合成，引物序列如表1。

表1 引物序列及擴增片段大小

1.2.2 病料DNA抽提 將疑似陽性病料進行剪碎、研磨，加入2倍體積生理鹽水配成1∶2的懸液，放入-70 ℃超低溫冰箱反復凍融3次后，8 000 r/min離心5 min，收集200 μL樣品，參照DNA抽提試劑盒說明書抽提核酸，-20 ℃保存備用。

1.2.3 標準品的構建 將抽提物用鑒定引物PCR擴增后經瓊脂糖凝膠電泳并回收，回收產物連接pMD-18T載體后，轉化JM109大腸桿菌，經過搖菌挑菌、抽提質粒，送華大基因科技服務有限公司測序。檢測其濃度作為陽性標準品備用。

1.2.4 PCR方法的建立 通過改變單一要素分別對模板量(1～2.5 μL)、PCR循環次數(25～40)、退火溫度(52.5 ℃～59.6 ℃)等條件進行優化，以獲得最佳的PCR反應條件。

1.2.5 特異性試驗 分別選取豬圓環病毒3型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型、偽狂犬病病毒的病毒液提取基因組后用以上鑒定引物及優化后的條件進行PCR擴增、電泳，檢測其特異性。

1.2.6 敏感性試驗 將標準品PMD-PCV3進行10-1～10-9稀釋，利用優化后的條件分別進行PCR擴增、電泳，檢測敏感性。

1.2.7 重復性試驗 采用優化后的PCR方法對來自全國的3份陽性病料提取的DNA分別重復3次擴增，共擴增9次，重復多孔同步檢測驗證其重復性。

1.2.8 臨床樣品檢測 對來自云南、四川、重慶等14個省(市)90多家豬場的322份樣品進行檢測，樣品包括流產胎兒和仔豬的心臟、肝臟、肺臟、腎臟等組織。

1.2.9 PCV3 Cap蛋白基因檢測 應用1.2.1設計的引物對部分省份的PCV3陽性樣品進行PCR擴增 Cap蛋白基因并測序，采用DNAMAN軟件和MEGA6軟件與GenBank登陸的PCV3 Cap蛋白基因序列進行對比分析。

2 結果

2.1 標準品的構建 將鑒定引物經PCR獲得的約330 bp目的條帶回收，連接pMD-18T載體后，轉化大腸桿菌JM109，平板培養后經PCR挑取陽性菌株，測序后與GenBank登陸的PCV3序列比對，同源性為99%～100%，表明該序列確實為PCV3序列。取陽性菌株培養提取質粒后，檢測其濃度為252 ng/μL，經計算拷貝數為8.3×109/μL。將質粒作為陽性標準品放-20 ℃保存備用。

2.2 PCR方法的優化和建立 通過對PCR反應條件的優化，得到PCR擴增的最佳反應體系為：rTaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2.5 μL，加ddH2O至總體系20 μL。PCR最佳反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56.7 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環。如圖1所示，成功擴增到約330 bp的PCV3目的條帶。

2.3 特異性試驗 結果顯示，豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型病毒(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)病毒液均未擴增到條帶(圖2)，PCV3陽性樣品擴增到約330 bp的條帶，表明建立的PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖1 PCV3 核酸PCR擴增

M：Marker； 1～2：PCV3目的條帶

圖2 特異性試驗

M：DL-2 000 ； 1：PCV3 ； 2：CFSV ； 3： PRRSV ； 4： PCV2 ； 5： PRV

2.4 敏感性試驗 將標準品PMD-PCV3作10倍系列稀釋，從10-1稀釋至10-9，用建立的PCR方法分別進行擴增、電泳，檢測引物的敏感性。結果顯示，當樣品稀釋至10-8時，用該方法檢測為陽性(圖3)，通過換算其檢測下限為830拷貝/μL，表明該方法具有良好的敏感性。

圖3 敏感性試驗

M： DL-2 000 ； 1～9泳道：模板濃度分別為10-1～10-9

2.5 重復性試驗 用建立的PCR方法對來自全國的3份陽性病料提取的DNA擴增，每份重復3次共擴增9次，結果均為陽性，表明該方法重復性良好。

2.6 臨床樣品檢測 從2017年10月份至2018年7月份，對來自云南、四川、重慶等14個省(市)的94家豬場的332份樣品進行檢測，樣品包括流產胎兒和仔豬的心臟、肝臟、肺臟、腎臟等，檢測結果顯示：在8個省(市)的樣品中檢測到PCV3(表2)， 豬場陽性率為36.5%，個體陽性率在23.2%，其中養豬大省，四川、廣東、河南等檢出率均高于27%，從PCV3的流行分布情況來看，主要集中在我國中西部、中東部以及華南地區。

表2 樣品檢測信息

2.7 PCV3的Cap蛋白基因分析 隨機挑取6個省(市)的樣品進行Cap蛋白基因擴增并測序。經同源性分析，6份Cap蛋白基因序列之間的同源性為98.6%～100%，與國內序列同源性為97.3%～99.3%，與泰國序列為97.6%～98.3%，與韓國序列為97.5%～99.3%，與巴西序列為97.6%～99.2%，與意大利序列為98.6%～99.3%，與美國序列為97.3%～98.1%，與瑞典序列為97.8%～98.5%(圖4)；經分子進化分析，2018年檢測到的6個PCV3 Cap蛋白基因序列與2016-2017年間檢測到的并不在同一進化分支，而是獨立處于另一小分支上(圖5)。

3 討論

2015年美國堪薩斯州立大學Palinski等研究人員從北卡羅來納州的一個暴發PDNS(皮炎和腎病綜合征)的豬場中分離到了一種新型豬圓環病毒，并且通過宏觀基因組測序和遺傳進化分析將其命名為豬圓環病毒3型(PCV-3)[2]。隨后在西班牙、泰國、韓國等地相繼報道在患病豬只中發現PCV3[6]。2017華中農業大學何啟蓋教授對我國PCV3臨床調查，經調查發現我國8個省和1個直轄市存在PCV3陽性豬只[1-3]，同時劉曉旭等人對我國安徽、山東等10個省份的66個豬場進行流行病學調查顯示，我國部分省(區)陽性率較高[7]。因此如何及時、準確的檢測PCV3，成為預防和控制PCV3的關鍵。PCR技術具有靈敏、簡單、特異、快速且易于操作等特點，得到了廣泛的應用[8]。

圖4 PCV3 Cap蛋白基因同源性分析

圖5 PCV3 Cap 遺傳進化樹

應用本實驗室所建立的PCV3檢測方法對來自河南、陜西、江西、廣西、四川、重慶等14個省及直轄市332例疑似病料進行檢測，結果顯示，豬場陽性率為36.5%，個體陽性率為23.2%。由此可見，PCV3已經成為流行趨勢，并具有蔓延的態勢。本研究并未對東北三省的PCV3流行情況進行調查，但是根據目前報道來看，東北三省PCV3陽性率并不高，由此可以看出PCV3流行傳播具有區域性。

本研究隨機挑取6個省(市)的樣品進行Cap蛋白基因擴增并測序，與2016-2017年間世界各地在GenBank登陸的序列進行比較，結果顯示，6份Cap蛋白基因序列之間的同源性為98.6%～100%，與國內序列同源性為97.3%～99.3%，與泰國序列為97.6%～98.3%，與韓國序列為97.5%～99.3%，與巴西序列為97.6%～99.2%，與意大利序列為98.6%～99.3%，與美國序列為97.3%～98.1%，與瑞典序列為97.8%～98.5%，表明不同地域之間的PCV3 Cap基因序列已存在一定的差異，從遺傳進化樹分析，2018年所檢測到的6個PCV3 Cap蛋白基因與2016-2017年檢測到的并不在同一進化分支，由此推測PCV3隨著時間推移，存在部分的基因突變。通過本次試驗，可以為進一步預防和控制PCV3的傳播蔓延打下理論基礎。