藍狐腦炎原蟲病的診斷與鑒定

李 志，劉麗凡，穆國冬，章悟善，張媛媛，黃巧蓉，馬澳琳，謝路遙，王 好

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春130118 ； 2.長春科技學院，吉林長春130600 ；3.吉林省動物疫病預防控制中心，吉林長春130000 ； 4.吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春130062)

2017年5月初，吉林省九臺市某藍狐養殖場養殖的1-4月齡藍狐出現不同程度脫水、生長停滯，眼睛失明，腹部觸摸可以摸到腫大的腎臟，被當地人稱之為“大腎病”。盡管藍狐大腎病的流行已有報道，但由于該病發生原因復雜，病毒、血液附紅細胞體檢測未出現異常，并未檢測出病原[1]。本實驗室懷疑藍狐發病為狐腦炎原蟲病，并去當地收集病狐進行臨床診斷和實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 革蘭染色液、改良馬松三色染色液、質粒小量提取試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T 載體和限制性內切酶EcoR I、HindIII，購自TaKaRa 公司；E.coliDH5α，購自北京全式金生物技術有限公司；DNA 膠回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.2 病料樣品的采集和處理 5例病料樣品采集于吉林省九臺地區某農場，為發病藍狐的腎臟、腦組織，-20 ℃冰箱冷凍保存；部分新鮮腎臟組織10%甲醛固定用于制備石蠟切片。

1.3 腦炎原蟲的純化和電鏡觀察 無菌條件下取5例典型病變的腎臟組織研磨，加入磷酸鹽緩沖液稀釋，并使用200 μm篩網過濾。濾液差速離心，操作如下：300 r/min離心5 min，收集上清液；將上清液4 000 r/min離心10 min，多次重復操作，收集底部沉淀，加少量磷酸鹽緩沖液，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 病理切片染色 將10%甲醛固定的組織室溫放置1周；經過脫水、包埋、修塊、切片、革蘭染色和改良馬松三色染色等步驟后，蓋玻片固定保存，觀察病理變化。

1.5 PCR鑒定及序列分析

1.5.1 引物設計與合成 參考GenBank 登錄的腦炎原蟲基因組序列，選取ITS1、PTP1基因序列保守區域，應用Primer 5.0軟件設計引物。PITS1F:5′-TTGACGGAAGGACACCACAAGGAGT-3′，PITS1R: 5′-CC-CGCCAAACGCAGTTACCA-3′；PPTP1F：5′-CCGGAATTCATGTATTCAGCAACCGCA-3′ ，PPTP1R：5′-CCGCTC GAGTTACTAGCAGCATTGG-3′。PCR 擴增產物預期為762 bp、1 128 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 DNA的提取與PCR 鑒定 將腎臟、腦組織研磨液分別處理。反復凍融3次，堿裂解法提取DNA，并進行PCR 擴增。ITS1基因的PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、62.3℃ 30 s、72 ℃ 30 min， 30個循環；72 ℃ 10 min。PTP1基因的PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60.4 ℃ 30 s、72 ℃ 30 min， 30個循環；擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.3 目的基因的回收與連接 PTP1基因PCR產物經純化后連接于pMD18-T載體中，轉化E.coliDH5α感受態細胞，在含有氨芐青霉素終濃度100 μg/mL的LB 瓊脂平板上篩選單菌落，LB培養基中180 r/min振蕩培養過夜，提取重組質粒，并使用限制性內切酶EcoR I和HindIII進行雙酶切驗證。

1.5.4 序列比較及進化樹繪制 陽性重組質粒由北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。利用DNASTAR軟件將基因測序結果與GenBank 登錄的參考病毒株進行序列同源性分析并采用MEGA 7.0構建系統進化樹。

2 結果

2.1 臨床診斷結果 受感染的農場主要以藍狐養殖為產業，典型癥狀為食欲不振、生長停滯、失明、痙攣，并且該疾病可經垂直傳播(見中插彩版圖1)。大多數受感染的狐貍，經剖檢可觀察腎臟蒼白、腫大(見中插彩版圖2)。

圖1 生長停滯的4月齡藍狐

圖2 病狐腎臟腫大蒼白癥狀

2.2 病原的純化結果 取初步純化的菌株經革蘭染色、改良馬松三色染色，油鏡觀察。革蘭染色觀察，在細胞碎片凝集物周邊有大量深藍色圓形或橢圓形類似假囊的結構；改良馬松三色染色呈粉紅色，大小在1～2 μm左右(見中插彩版圖3)。

圖3 經初步純化的微孢子蟲的染色

2.3 病理觀察結果 為了進一步鑒定腦炎原蟲病，將固定的組織做石蠟病理切片并染色，400倍顯微鏡下觀察，在腎臟間質和腎髓質明顯觀察到孢子存在。革蘭染色觀察到腎上皮內和腔內以及脾臟小梁的孢子顯示為粉紅色背景下可見的深藍色圓形結構(見中插彩版圖4A和4C箭頭所指)。改良馬松三色染色可觀察到腎小管上皮內藍色背景下大量粉紅色卵圓形結構(見中插彩版圖4B箭頭所指)。

圖4 藍狐組織染色觀察

2.4 PCR鑒定與序列分析結果

2.4.1 PCR鑒定結果 將ITS1 基因、PTP1基因進行PCR 擴增，產物凝膠電泳檢測結果顯示，擴增出約831 bp、1 071 bp的特異性片段(圖5)。將其連接至pMD18-T載體中，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖5 分離株PTP1、ITS1基因PCR擴增產物

M：.DL-2 000 DNA Marker ； 1：陰性對照 ；2：ITS1擴增產物 ； 3：PTP1-pMD-18T酶切產物

2.4.2 基因序列分析結果 對測序結果進行分析，PTP1、ITS1基因在GenBank上進行比對。結果表明，ITS1基因與參考株GB-M1的同源性為99.7%，并且ITS1基因5′-GTTT-3′重復4次，與LN-1株同屬一個基因III型，將分離株命名為JL-1。同時，PTP1基因進化樹分析也表明該分離株與遼寧株(LN-1) 及美國株(CDC)親緣關系最近(圖6)。其中NM001041403、AJ005666、AF310678基因分離自小鼠，EU282236、EU282237和AB182700分離自猴子，AF310679分離自人。

圖6 基于Neighbor-Joining 法構建立 PTP1基因核苷酸序列遺傳進化樹

3 討論

經實驗室診斷分析，確定該藍狐養殖場暴發的疾病為腦炎原蟲病。

在實驗室診斷的多個腎臟、腦組織石蠟切片染色、研磨液中檢測到大量腦炎原蟲，證明腦炎原蟲極有可能寄生在藍狐腎臟并排出具有感染性的孢子，經口腔感染給同群藍狐。同時，藍狐發病的窩發性和母狐的發病史也證明了該病傳播與遺傳有關，腦炎原蟲可能經胎盤傳播給子代。腎臟、腦組織DNA的PCR鑒定，經ITS1基因序列分析證明了藍狐腦炎原蟲基因Ⅲ型感染。2012年初，中國首次出現藍狐腦炎原蟲基因Ⅲ型，但傳染來源無從知曉。在歐洲，只有腦炎原蟲基因Ⅲ型感染犬、猴、免疫缺陷病人和腎臟移植患者[2-4]。因此此次藍狐腦炎原蟲病的暴發有潛在的人獸共患風險，特別是對免疫能力較弱的老人和兒童。

目前腦炎原蟲病尚未有特效治療藥物。僅發現某些抗生素(例如：煙曲霉素，司帕沙星，土霉素)，特別是苯并咪唑對腦炎原蟲感染能夠起到一定抑制作用[5]。但在治療中斷幾個月后，往往會在宿主體內再次檢測到腦炎原蟲[6]。因此感染腦炎原蟲病的藍狐特別是母狐必須淘汰，并使用濃度為1.0%甲醛、1.0%過氧化氫、1.0%氫氧化鈉、70%乙醇、10%次氯酸鈉等常規消毒劑對養殖區域進行定期徹底的清潔，減少病原傳播。

東北地區是毛皮動物養殖的主要分布地區之一，占有非常重要的地位。藍狐對腦炎原蟲病高度易感，但在國內僅有1例藍狐感染報道。并且腦原蟲病可能已在狐場肆虐幾年，在最初只有數只幼狐感染，后來50%幼狐死亡，由于不能有效控制疫情，養殖戶不得不處死母狐。在2002年，腦炎原蟲病造成了芬蘭藍狐的高死亡率和巨大的經濟損失[7]。因此，此次狐場的兔腦原蟲調查極為重要。