柔嫩艾美耳球蟲分泌性蛋白生物信息學分析

許中衎 , 王黎霞 , 王 靜 , 李 暢 , 喬尚怡 , 張榕珍 ,張一弛 , 芳 卉 , 張建軍 , 安 健

(1.北京農學院動物科學技術學院 國家級動物類實驗教學示范中心，北京昌平102206 ；2.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京房山102442)

雞球蟲病是由艾美耳屬的單種或多種雞球蟲引起的主要侵襲雞腸道的全球性寄生蟲病，是我國嚴重危害養禽業的常見疾病之一。經統計，全球養禽業每年因球蟲感染造成的經濟損失高達20億美元之多[1]。

迄今為止，防治雞球蟲病仍以藥物治療為主，但隨著時間的積累，球蟲表現出的耐藥性也逐步增強，而藥物殘留所帶來的危害也開始引起人們的關注，這使得越來越多的研究人員將目光由控制、治療球蟲病轉向免疫預防這條途徑[2]，研發新型疫苗成為預防雞球蟲病的主要發展方向。頂復門原生寄生蟲入侵宿主細胞的過程包括粘附、侵入、形成納蟲空泡、寄生[3]。而參與以上過程的相關蛋白分子是眾多重要的雞球蟲抗原，如棒狀體、微線體等蛋白，這些雞球蟲抗原都或許可作為研制雞球蟲病新型疫苗的候選因子[4-6]。本試驗通過將E.tenella第二代裂殖子和MDBK細胞進行無血清間接共培養，獲得了主要E.tenella多種外分泌性蛋白，接著對這些蛋白的理化性質、信號肽等進行預測分析，預測其作為疫苗候選抗原的可能性。本次試驗為分泌性蛋白的生物學功能研究奠定基礎，也為今后雞球蟲病疫苗的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株E.tenellaB4株，由北京農學院病理實驗室提供，分離自昌平某雞場，復壯周期為3個月。

1.1.2 細胞 MDBK細胞，本實驗室保存用于雞球蟲研究的貼壁細胞系。

1.1.3 試驗動物 1日齡農大3號公雞雛，將其飼喂于無球蟲及其他病原環境中，使用不含抗球蟲藥的雛雞飼料，飼喂至14日齡，期間自由采食。

1.1.4 主要試劑 TRIzol,購自美國Ambion公司；DNA Marker,購自天根生化科技(北京)有限公司；反轉錄試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，購自美國TaKaRa公司；2×TaqDNA聚合酶,購自北京康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶EcoR I/NotI、DNA連接酶，購自美國NEB公司；E.coliDH5α感受態細胞,購自北京中美泰和生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1E.tenella第二代裂殖子的收集 取柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按7×104/只接種7日齡無球蟲雞；112 h后剖殺取盲腸，浸于洗脫液內，剪開盲腸，洗去盲腸內容物；將剪開的盲腸置于冰上，于洗脫液中刮下腸黏膜，統一收集以上洗脫液后勻漿，使裂殖子游離出來；200目和100目網篩過濾勻漿；將所得濾液1 500 r/min離心10 min，棄去上清，洗脫液重懸沉淀；600 r/min離心8 min，收集上清(因慢速離心下，質量較大的紅細胞和雜質會沉下，裂殖子會懸浮于上清液中，故收集上清)。上清經1 500 r/min離心10 min，取沉淀；適量洗脫液重懸沉淀，置于42 ℃水浴中。裝柱：將配置好的DE-52纖維素(配制方法略)裝入直徑1 cm，高約30 cm的層析柱中至柱高4～5 cm。將裂殖子重懸液加入層析柱中，收集純化后的裂殖子。

1.2.2E.tenella與MDBK細胞的間接共培養 計數純化后的裂殖子1 200萬個/孔， 置于42 ℃中保持活性，準備好共培養；待MDBK細胞長至80%鋪滿瓶底后，進行細胞換液，將完全培養液換成無血清無雙抗的DMEM；放入Transwell；將含有裂殖子的洗脫液置于Transwell小室中，隔離共培養12 h，共重復3孔；取3孔上清液置于10 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質定性分析。

1.2.3 液相色譜-串聯質譜分析 將樣品(上清液)用蛋白酶降解，使得長鏈的蛋白質剪切成短鏈的肽段；酶解后的蛋白片段通過質譜測定，選擇出離子豐度較高的肽段進一步破碎得到各種碎片離子，再通過Mascot檢索軟件，與蛋白質數據庫相對比進行蛋白鑒定，確定蛋白。

1.2.4 生物信息學分析 運用SOPMA、TMHMM、Protscale、SignalP、抗原表位預測軟件和Phyre2.0等生物信息學軟件預測這些蛋白質的理化性質、二級結構、疏水性、信號肽、抗原表位和三維結構等，預測其作為疫苗候選抗原的可能性。

2 結果

2.1E.tenella外分泌性蛋白的LC-MS/MS檢測 將液相色譜-串聯質譜檢測到的蛋白數據連接Mascot檢索軟件，圖1是Mascot檢索軟件打分結果，橫坐標指匹配的蛋白得分，縱坐標指匹配的蛋白數目，柱是指匹配的結果，陰影內(蛋白得分<33)表示小于閾值分數的不可信結果，即打分大于33分的蛋白99%以上為該蛋白。得分前4位蛋白如表1所示。

圖1 LC-MS/MS檢測結果

表1 LC-MS/MS檢測結果

2.2E.tenella外分泌性蛋白的生物信息學分析 利用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預測以上所得到的4種蛋白的二級結構得知，Hsp90中參與α-螺旋形成的氨基酸占50.98%，參與β-轉角形成的氨基酸占5.90%，參與延伸鏈形成的氨基酸占14.61%，參與無規則卷曲形成的氨基酸占28.51%；Histone 4中參與α-螺旋形成的氨基酸占46.60%，參與β-轉角形成的氨基酸占11.65%，參與延伸鏈形成的氨基酸占14.56%，參與無規則卷曲形成的氨基酸占27.18%；HP中參與α-螺旋形成的氨基酸占63.09%，參與β-轉角形成的氨基酸占8.72%，參與延伸鏈形成的氨基酸占3.36%，參與無規則卷曲形成的氨基酸占24.83%；Ribosomal protein中參與α-螺旋形成的氨基酸占23.26%，參與β-轉角形成的氨基酸占9.30%，參與延伸鏈形成的氨基酸占18.6%，參與無規則卷曲形成的氨基酸占48.84%。此外發現，4個蛋白均無β-折疊結構(如表2)。

表2 外分泌性蛋白的二級結構預測

利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對以上所得4種蛋白的跨膜結構域進行分析，結果發現Hsp90(見中插彩版圖2左上)，Histone 4(見中插彩版圖2右上)，HP(見中插彩版圖2左下)和Ribosomal protein(見中插彩版圖2右下)的膜內區域幾率均極低，說明這4種蛋白均無跨膜區。

圖2 外分泌性蛋白的跨膜結構域分析

利用Protscale在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/)分析以上所得4種蛋白的疏水性質，結果發現Hsp90(圖3左上)多肽鏈，Histone 4(圖3右上)多肽鏈，HP(圖3左下)多肽鏈和Ribosomal protein(圖3右下)多肽鏈均具有極強的疏水性。

圖3 外分泌性蛋白的疏水性分析

利用SignalP在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對以上所得4種蛋白的信號肽進行分析，結果分別得到：Hsp90(見中插彩版圖4左上)的C=0.139，S=0.788，Y=0.289，D=0.494，在第16和17位氨基酸之間有剪切位點的可能性較大，推斷Hsp90存在信號肽；Histone 4(見中插彩版圖4右上)的C=0.170，S=0.682，Y=0.313，D=0.459，在第17和18位氨基酸之間有剪切位點的可能性較大，推斷Histone 4存在信號肽；HP(見中插彩版圖4左下)的C=0.163，S=0.616，Y=0.256，D=0.369，推斷Hypothetical protein(HP)不存在信號肽；Ribosomal protein(見中插彩版圖4右下)的C=0.131，S=0.510，Y=0.212，D=0.292，推斷Ribosomal protein不存在信號肽。

圖4 外分泌性蛋白的信號肽分析

利用Immunomedicine Group在線軟件(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預測以上所得到的4種蛋白潛在的抗原決定簇，結果發現Hsp90(圖5左上)，Histone 4(圖5右上)，HP(圖5左下)和Ribosomal protein(圖5右下)均存在有許多連續的峰值，這些峰值指代潛在的抗原表位，Hsp90存在24個潛在的抗原表位；Histone 4存在4個潛在的抗原表位；HP存在5個潛在的抗原表位；Ribosomal protein存在5個潛在的抗原表位。

利用Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)對以上所得4種蛋白的三維結構進行預測，蛋白三維結構模型如圖6所示。經在線軟件分析4種蛋白三維結構模型的可信度分別是100%、100%、99.9%和99.9%，說明4種蛋白模型具有很高的可信度。

圖5 外分泌性蛋白的抗原表位分析

圖6 外分泌性蛋白的三維結構預測

3 討論

因生物信息學與傳統的統計學方法相比，具有高效和低成本的特點[7]，故如今用生物信息學分析預測未知蛋白的生物學功能、結構和其他生物特性的研究越來越多。雞球蟲病是我國嚴重危害養禽業的常見疾病之一，每年都會造成養雞業的巨大的經濟損失，所以對雞球蟲病的防治不可輕視。

E.tenella入侵宿主細胞的過程需要通過粘附、侵入、形成納蟲空泡后寄生于宿主細胞內，而在它的寄生過程之中，行使主要入侵作用的蛋白分子可能就是我們免疫預防研究中的主要球蟲疫苗抗原。故本試驗通過用Transwell小室將E.tenella第二代裂殖子和MDBK細胞隔離共培養12 h后，收集蛋白培養液上清，以此來獲得主要的外分泌蛋白分子，通過一系列生物信息學分析預測這些蛋白作為球蟲疫苗候選抗原的可能性。

本試驗通過生物信息學分別分析4種蛋白的二級結構、跨膜結構域、親疏水性、信號肽、抗原表位以及三維結構，在利用SOPMA分析二級結構時發現，Hsp90、Histone 4、HP和Ribosomal protein的二級結構主要是由α-螺旋、無規則卷曲以及β-轉角所構成的，且均沒有β-折疊，在蛋白質的二級結構中，α-螺旋和β-折疊的結構相對穩定，而無規則卷曲和β-轉角的結構較為松散又不穩定，就能更好的與抗體結合，參與免疫反應[8]，以上結構分析結果說明4種蛋白均有作為抗原的結構潛力。在利用TMHMM做跨膜結構域分析時，橫坐標指的是序列位置，縱坐標指的是幾率[9]，結果發現4種蛋白的膜內區域幾率均極低，而膜外區域幾率都很高，說明這4種蛋白均無跨膜區。蛋白質的親疏水性是構成蛋白質折疊的主要驅動力。蛋白質折疊時會形成疏水內核和親水表面，同時有潛在跨膜區出現高疏水值區域，據此可以測定跨膜螺旋等二級結構和蛋白質表面氨基酸分布[10]。在利用Protscale做親疏水性的分析中，認為位于1.0～3.0表示高疏水性氨基酸，反之位于-1.0～-3.0的區域即親水性較強的區域，結果發現4種蛋白多肽鏈均具有極強的疏水性。在利用SignalP做信號肽分析時，C值最高峰值是指該位點很可能是剪切位點，Y值最高峰值是指最佳的剪切位點，S值則用來區分該位點是否為信號肽部位，D值是S-mean和Y-max的加權平均值，可以用來區分分泌及非分泌蛋白，分泌性蛋白計算值高，反之則低[11]。結果發現Hsp90和Histone 4存在信號肽，分別在16～17和17～18氨基酸之間可能存在最佳剪切位點，而HP和Ribosomal protein則不存在信號肽。在利用Immunomedicine Group做抗原表位分析時發現，4種蛋白均存在抗原表位，Hsp90存在24個潛在的抗原表位，Histone 4存在4個潛在的抗原表位，HP存在5個潛在的抗原表位，Ribosomal protein存在5個潛在的抗原表位，抗原表位的存在說明4種蛋白作為抗原均能夠引起良好的免疫反應，故這些蛋白有可能成為柔嫩艾美耳球蟲最為重要的潛在藥物靶點或疫苗候選抗原。最后對4種蛋白三維結構建模，結果顯示，Hsp90、Histone 4、HP和Ribosomal protein主要是由α-螺旋、無規則卷曲以及β-轉角組成，與各蛋白相應的二級結構預測結果相一致，且可信度高，基本能夠反映4種蛋白的空間構象。這4種蛋白三維結構模型的構建有利于可視化分析，也為今后研究其構效關系提供了理論基礎。

通過間接共培養獲得的這4種蛋白，Hsp90是具有高度保守性的蛋白質，在基因轉錄和細胞生長、分化等方面均發揮著重要作用。有研究發現，雞堆型艾美耳球蟲Hsp90能夠提高雞的免疫應答，包括體液免疫和細胞免疫[12]。Histone 4是真核生物染色質的基本結構蛋白，當細胞壞死時會被釋放到細胞外發揮炎癥作用[13]。Histone 4是真核生物染色質的基本結構蛋白，當細胞壞死時會被釋放到細胞外發揮炎癥作用。在其他頂復門原蟲，如發現Histone能夠與外周網狀物質結合將利什曼原蟲在細胞外殺死[14]，說明它具有殺死細胞外細菌或外來物質的作用。Ribosomal protein是參與生物系統發育與分化的重要蛋白。在利什曼原蟲發現能保護機體引起T細胞的分泌[15]；在日本血吸蟲被發現具有免疫保護效果[16]。這些研究表明，這3種蛋白都被發現能夠作為抗原引起機體的免疫應答。而HP的功能至今雖還不清楚，但通過生物信息學分析發現HP不存在信號肽，存在抗原表位，且具有易于發生結合反應的結構。

總的來說，結構分析發現4種蛋白均無跨膜區，主要由α-螺旋、無規則卷曲以及β-轉角組成，這種結構導致蛋白不穩定，易發生免疫反應?？乖砦环治霭l現4種蛋白均存在抗原表位，這說明它們均能夠引起良好的免疫反應。且其他頂復門原蟲的Hsp90、Histone 4和Ribosomal protein均被研究出具有免疫原性。綜上推測這4種蛋白有望成為重要的潛在藥物靶點或疫苗候選抗原。

在獲得的4種蛋白中，HP蛋白因具有以下幾個特點被認為具有作為疫苗候選抗原的可能性，首先HP蛋白還未被研究過；其次HP蛋白無信號肽，目的蛋白就不會進行定位，同樣，目的蛋白就不會有信號肽被細胞識別切除，從而使得外源表達目的蛋白能夠正確折疊以及提高了外源表達蛋白時的分泌性效率[17-18]，故接下來會通過外源表達對HP蛋白進行研究，預測其成為新型疫苗的候選抗原的可能。