胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌對小鼠巨噬細胞凋亡的影響

張麗嬌，趙彤彤，梁云霞，王春芳，王春鳳，錢愛東

(1. 長春師范大學生命科學學院，吉林長春130032 ; 2. 吉林農業大學動物科學學院，吉林長春130000)

目前非結核分枝桿菌(Nontuberculous Mycobacterium，NTM)感染及其致病性越來越受到重視，有報道證實，新金色分枝桿菌可引發肺部感染，嗜血分枝桿菌引發眼內炎、淚囊炎和頸面部淋巴結炎等等[1-5]。分枝桿菌感染機體后，第一步感染巨噬細胞，通過與宿主細胞的斗爭最終存活下來，并且增殖[6]。但關于NTM與巨噬細胞的相互作用方面研究尚少，本試驗主要觀察由吉林農業大學免疫與微生物實驗室分離鑒定出來的胞內分枝桿菌、偶發分枝桿菌對巨噬細胞系RAW264.7凋亡率及TNF-α及IL-10表達的影響，并且觀察了這2株菌在小鼠巨噬細胞中的吞噬及增殖情況。對進一步明確NTM與宿主巨噬細胞的作用機制以及NTM疾病的發病機理、制定治療措施具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 1株胞內分枝桿菌，1株偶發分枝桿菌均由吉林農業大學免疫與微生物實驗室分離鑒定；C57BL/6小鼠，雌性，6周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司； RPMI1640培養基、胎牛血清，Hyclone公司；7H9 培養基，BD公司；Triton X-100，北京索萊寶科技有限公司；熒光素雙醋酸酯(FDA)，Sigma公司；AnnexinV/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，BD公司；TNF-α、IL-10的ELISA檢測試劑盒，R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌在小鼠巨噬細胞中的吞噬及增殖 按常規方法制備小鼠骨髓巨噬細胞[7]，接種至24孔板( 5×105個/孔)。分成胞內分枝桿菌組、偶發分枝桿菌組及空白對照組，菌體( 5×106個/孔)與巨噬細胞作用2 h 后，清洗，加入 RPMI1640 培養基(含阿米卡星 20 μg/mL)，在感染后的 1、3、5、7 d，以 PBS (含0.1% Triton X-100) 裂解細胞，收集菌體。7H9 培養基培養菌體，檢測胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌在細胞中的增殖數量，計算吞噬率，吞噬率=被吞噬的菌數/細胞總數[8-9]。另外，感染1 d時收集的菌體，用FDA(0.5 μg/mL)染色，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌對巨噬細胞系RAW264.7凋亡率的影響 RAW264.7細胞(5×105個/孔)放在12孔培養板中，分成胞內分枝桿菌組、偶發分枝桿菌組及空白對照組，培養24 h后在每孔加細菌5×106個。4 h后，用PBS洗去沒有被吞噬的菌體，加入培養基，其中含阿米卡星(20 μg/mL)，之后使用AnnexinV/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，流式細胞儀檢測不同時間(0 h、4 h、12 h、24 h、48 h)各組細胞凋亡率。

1.2.3 胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌對RAW264.7 細胞TNF-α、IL-10表達的影響 按照說明書用ELISA法檢測RAW264.7細胞感染后各組不同時間點(0 h、4 h、12 h、24 h、48 h)培養上清中TNF-α及IL-10的表達，最后用酶標儀于450 nm波長處檢測OD值。

1.2.4 數據分析 作圖及數據分析用Graphpad Prism 5.0軟件。組間差異用t檢驗。

2 結果

2.1 胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌在小鼠巨噬細胞中的吞噬及增殖 感染第1天，2株NTM都被小鼠骨髓巨噬細胞所吞噬，胞內分枝桿菌的吞噬率高于偶發分枝桿菌(表1)。在倒置熒光顯微鏡下同樣觀察到2株NTM被巨噬細胞吞噬(見中插彩版圖1)。

圖1 NTM在小鼠骨髓巨噬細胞中的吞噬情況

a： 胞內分枝桿菌 ； b： 偶發分枝桿菌

2株菌感染3、5、7 d后增殖明顯，胞內分枝桿菌在巨噬細胞中增殖速度比偶發分枝桿菌快(P<0.01)(圖2)。

表1 非結核分枝桿菌感染小鼠骨髓巨噬細胞的吞噬率

與偶發分枝桿菌組比較, *P<0.05

圖2 NTM在小鼠骨髓巨噬細胞中的增殖情況

2.2 胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌對巨噬細胞系RAW264.7凋亡率的影響 如圖3所示，感染0 h，胞內分枝桿菌組、偶發分枝桿菌組及空白對照組差異不顯著。隨著時間延長，各感染組凋亡率開始升高，與空白對照組差異極顯著(P<0.001)，其中偶發分枝桿菌組凋亡率升高最明顯，其次是胞內分枝桿菌組。凋亡率的高低可能與菌體毒力有關。

2.3 胞內分枝桿菌及偶發分枝桿菌對RAW264.7 細胞TNF-α、IL-10表達的影響 收集RAW264.7細胞上清液ELISA法檢測TNF-α、IL-10表達的變化，在 4 h、12 h，胞內分枝桿菌組及偶發分枝桿菌組TNF-α的表達值與空白對照組相比都較高，差異顯著(P<0.05)，并且胞內分枝桿菌組TNF-α的表達量高于偶發分枝桿菌組，差異顯著(P<0.05)；但在24 h、48 h，2個試驗組TNF-α表達值下降明顯，與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖4)。在4 h、12 h，胞內分枝桿菌組及偶發分枝桿菌組IL-10的表達值與空白對照組相比都較高，差異顯著(P<0.05)，并且下降不明顯，保持高表達，并且胞內分枝桿菌組IL-10的表達量高于偶發分枝桿菌組，差異顯著(P<0.05)(圖5)。

圖3 NTM對巨噬細胞凋亡率的影響

圖4 NTM對RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

與空白對照組比較， *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001

圖5 NTM對RAW264.7細胞IL-10表達的影響

與空白對照組比較， *P<0.05 ,**P<0.01 ,***P<0.001

3 討論

有研究證明，結核分枝桿菌強毒株在巨噬細胞中的存活及繁殖能力要高于弱毒株[10]。因此，分枝桿菌在巨噬細胞中的生存狀態及數量可以作為評價菌株毒力高低的一個重要指標；有研究發現，腹腔巨噬細胞對強毒株H37Ra的吞噬率高于滅活菌H37Rv[9]，說明巨噬細胞對分枝桿菌的吞噬率也是驗證菌體毒力及易感性的一個重要標準。

為了探究非結核分枝桿菌感染巨噬細胞后的增殖情況，我們觀察了小鼠骨髓巨噬細胞吞噬胞內分枝桿菌、偶發分枝桿菌的情況，并且在1、3、5、7 d檢測NTM在巨噬細胞中的數量。結果發現，不同菌體感染后的增殖情況各有不同，可能與其毒力有關，在感染過程中2株菌都被吞噬并在細胞中增殖，胞內分枝桿菌相比于偶發分枝桿菌吞噬數量及增殖都更為顯著。我們推測胞內分枝桿菌毒力及易感性均高于偶發分枝桿菌。

巨噬細胞通過凋亡來抑制菌體的感染是一種常見的方式，有相關研究表明，不同的菌體感染巨噬細胞后引起的凋亡率不同[11-13]。這可能與菌體的毒力相關，但菌體種類繁多，我們還需要深入研究相關機制。因此，我們用胞內分枝桿菌和偶發分枝桿菌感染RAW264.7巨噬細胞。結果顯示，胞內分枝桿菌和偶發分枝桿菌都引起了巨噬細胞的凋亡。胞內分枝桿菌組凋亡率高于偶發分枝桿菌組。更進一步說明凋亡率和毒力的關系，推測是由于胞內分枝桿菌的毒力更強所以引起的凋亡率反而更低。

分枝桿菌感染巨噬細胞后，會引起很多細胞因子的分泌，TNF-α屬于炎性細胞因子，促進保護性免疫[14]。而IL-10屬于抑制性細胞因子，阻礙細胞免疫[15]。我們分析了這2個重要的細胞因子在胞內分枝桿菌和偶發分枝桿菌感染巨噬細胞過程中的變化。結果顯示，在感染初期，胞內分枝桿菌和偶發分枝桿菌都引起了這2種細胞因子的高表達，顯著高于空白對照組，但后期，TNF-α的表達量開始下降，而IL-10持續高表達。IL-10持續高表達有可能是炎性因子TNF-α表達下降的原因。并且胞內分枝桿菌在整個過程中細胞因子的表達量都較高，這也可能與毒力相關。

目前關于NTM與巨噬細胞相互作用的機制的研究還不夠深入，本試驗為NTM與宿主巨噬細胞調控作用的機制研究奠定基礎。