10株廣西野鳥源新城疫病毒HN基因的遺傳進化分析

謝麗基，謝芝勛，羅思思，鄧顯文，謝志勤，王 盛，黃嬌玲 ，曾婷婷，張艷芳，范 晴，張民秀

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西南寧530001)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的以感染禽類為主的一種急性、烈性傳染病。NDV 基因組包含 6 個基因，分別編碼 3′NP-P-M-F-HN-L5′六種結構蛋白。HN糖蛋白具有血凝素和神經氨酸酶活性，在病毒侵染過程中識別細胞受體，介導病毒吸附細胞膜，是極其重要的保護性抗原[1]，對 NDV的毒力有很大的影響。抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因[2]。

野鳥作為新城疫病毒的自然儲存宿主，可能成為病毒的傳播媒介，隨自然遷徙可將病毒傳染給家禽，導致疾病暴發[3]。新疆、吉林、湖南和陜西等地均報道了對鳥類新城疫進行了監測，探索了野生鳥類與家禽新城疫感染的區別和聯系，通過分析新城疫病毒的遺傳進化情況，可預測新城疫病毒感染家禽的流行趨勢，可為新城疫的防治提供理論依據[3-4]。

本試驗對2016-2017年度從廣西野鳥分離到的10株NDV的HN基因，采用RT-PCR方法進行擴增和測序，并對其核苷酸序列進行遺傳進化分析，為科學防控新城疫提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 毒株 10株廣西野鳥源NDV分離株由本實驗室分離鑒定和保存，其中鷓鴣源2株，斑鳩源5株，鴿子源3株。

1.2 主要試劑 病毒基因組RNA/DNA快速純化試劑盒和DNA片段膠回收試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex TaqTM試劑盒和pMD18-T試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3HN基因PCR擴增的引物 NDVHN基因擴增上游引物HN2265-F:5′-CCTMGATCAGATGAGAGC-3′，下游擴增引物HN2265-R:5′-TGTGACTCTGGTAGGAT-3′[5]，擴增的片段大小為2 265 bp。引物由深圳華大基因科技服務有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取、RT-PCR 取200 μL NDV分離株的病毒尿囊液，按照北京全式金生物技術有限公司的病毒基因組RNA/DNA快速純化試劑盒使用說明書，提取病毒 RNA，然后按照寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄試劑盒PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit使用說明書進行反轉錄。使用引物HN2265-F和HN2265-R進行PCR擴增。

1.5 PCR 產物膠回收、克隆測序 將50 μL PCR產物電泳后，切膠經DNA片段膠回收試劑盒純化回收。將純化PCR產物克隆至pMD-18T載體。陽性克隆送深圳華大基因科技服務有限公司進行測序。

1.6HN基因進化樹與同源性比較 應用Lasergen和MEGA 6軟件，對測序獲得的 10株NDV分離株HN基因序列，與GenBank數據庫中的NDV代表株進行序列對比分析，采用鄰位相連法(Neighbor-joining)和 Bootstrap值為1 000構建NDV分離株HN基因的系統進化樹。

2 結果

2.1 廣西野鳥源NDV分離株HN基因的PCR擴增和序列測定 運用RT-PCR對10 株野鳥源NDV分離株進行HN基因的擴增，均擴增出約2 265 bp的電泳條帶(圖1)。序列測定結果表明，10 株野鳥源NDV分離株HN基因的ORF全長均為1 716 bp，編碼571個氨基酸。

圖1 NDV 廣西分離株HN基因擴增結果

M: 100 bp DNA ladder ; 1: 鷓鴣源新城疫 ； 2: 鷓鴣源新城疫；3: 鴿子源新城疫 ； 4: 鴿子源新城疫； 5: 鴿子源新城疫 ； 6: 斑鳩源新城疫； 7: 斑鳩源新城疫 ； 8: 斑鳩源新城疫 ； 9: 斑鳩源新城疫 ； 10: 斑鳩源新城疫

2.2 廣西野鳥源NDV分離株HN基因序列的遺傳進化分析 應用Lasergen軟件，將測序獲得的 10株NDV分離株HN基因的閱讀框架序列，與GenBank數據庫中的NDV代表株序列進行比對，結果顯示，10株NDV廣西野鳥源分離株HN基因之間的核苷酸同源性為83.9%～99.9%(其中159 Francolinus pintadeanus19與173 Turtledove7同源性最低，為83.7%)，所推導的氨基酸序列同源性為87.4%～99.7%(其中159 Francolinus pintadeanus19與173 Turtledove7 的同源性最低，為87.4%)。與國內外 NDV class Ⅱ參考毒株的核苷酸同源性為80.2%～98.1%， 其中2株從鷓鴣分離的NDV病毒，與 NDV基因XII型的同源性較高，為98.0%～98.1%；而斑鳩源的5株NDV病毒，以及從鴿子源的3株NDV病毒，與NDV基因VI型的同源性較高，為90.0%～91.9%。構建的系統遺傳進化樹見圖2。所分離的10個NDV毒株，8株為Ⅱ類新城疫病毒基因VI型(斑鳩源5株，鴿子源3株)，鷓鴣分離的2株新城疫病毒，均為Ⅱ類新城疫病毒基因XII型。10株廣西野鳥NDV分離株與我國經典強毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我國目前應用最廣的疫苗株基因型之一)遺傳距離較遠(見圖2) 。

3 討論

NDV的HN基因開放閱讀框(ORF)有4種長度：第1種，ORF全長為1 851 bp，編碼 616個氨基酸，該蛋白只存在于無致病性的 NDV 弱毒株中；第2種，ORF全長為1 734 bp，編碼 577個氨基酸，存在于無致病性和致病性的 NDV 毒株中；第3種ORF 全長為1 716 bp，編碼 571 個氨基酸，僅存在于致病性的 NDV 強毒株中；第4種ORF全長為1 716 bp，編碼 571 個氨基酸，未確定存在于何種致病性的 NDV 毒株中[6]。本試驗測定的10 株廣西野鳥源 NDV分離毒株的HN基因ORF 均為 1 716 bp，編碼 571個氨基酸，符合 NDV 強毒株的基因長度特征，與用 NDVF基因裂解位點來判斷其為強弱毒株的結果一致[7]。

圖2 10株廣西野鳥源NDV分離株與國內外NDV參考株HN基因的遺傳進化樹

據報道，我國新疆、吉林、湖南和陜西等地野鳥分離的新城疫病毒，主要為Ⅱ類新城疫病毒基因I型、基因II型 和基因VI型[4]。與國內其他學者的報道類似，本試驗在廣西野鳥中也發現了Ⅱ類新城疫病毒基因VI型。近年來，在我國家禽首次監測到了Ⅱ類新城疫病毒基因XII型[8]，除了本團隊在2018年最新的研究報告[7]，未見在野鳥發現Ⅱ類新城疫病毒基因XII型的研究報道。本試驗發現我國鳥類感染了Ⅱ類新城疫病毒基因XII型，提示應警惕這種新型新城疫病毒在國內野鳥和家禽的分布和流行，加大主動監測力度，分析其流行和擴散趨勢。由于當前所使用的新城疫疫苗主要為基因VII型、基因II型和基因I型，鑒于我國基因XII型新城疫的新發現，有必要開展當前疫苗對XII型新基因型新城疫的免疫效果評估。

本試驗分離的10株新城疫病毒，分離時野鳥狀態均良好，無發病跡象，推測野鳥對基因VI型和XII型新城疫具有較好的適應能力與抵抗性，存在對周邊環境排毒的危險，廣西地區鳥類資源豐富，為新城疫病毒的傳播創造了便利條件。