丹參中三萜酸的分離及其抗炎活性的研究＊

黃莉婷，丁 昉，許瓊明，2，楊世林，2，高紅偉，3＊＊

（1.廣西中醫藥大學藥學院 南寧 530020；2.蘇州大學藥學院 蘇州 215123；3.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術中心 南寧 530020）

丹參Radix Salviae Miltiorrhizae是唇形科植物丹參的干燥根和根莖，它的主產地主要是在江蘇、山東、安徽、四川，大多數為栽培品；在春、秋二季采挖，除去它的莖葉、泥沙、須根，曬干。丹參最開始被記載于《神農本草經》，列為上品。它性微寒，味苦。歸心、肝經，具有活血通絡、祛瘀止痛、涼血消癰、清除心煩等功效，常用于治療心絞痛、冠心病及胸腹刺痛、經閉痛經等癥，入藥歷史悠久。《本草綱目》中記載，丹參活血，通心包絡，治疝痛；《本經》記載，丹參主治心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣；《別錄》記載，丹參養血，去心腹痼疾結氣，腰脊強腳痹，除風邪留熱，久服利人，具有“一味丹參，功同四物”的說法[1,2]。丹參作為一種傳統中藥，長期記載于《中國藥典》中，且成功被《美國藥典》收錄。丹參作為一個在臨床上被用了上千年的中藥，被開發出很多產品，如復方丹參滴丸、丹參片、復方丹參片、復方丹參注射液、丹參舒心膠囊、丹參酮膠囊等，尤其是丹參復方滴丸是第一個進入美國食品藥品監督管理局（FDA）臨床試驗的復方中藥，具有十分重要的意義。

圖1 三萜酸化學結構式

早在20世紀30年代，就有國內外的學者對丹參的化學成分進行了研究。丹參化學成分主要包括兩大類：一類是以丹參素（Propanoid acid）和丹酚酸（Salvianolic acid）為代表的水溶性成分，主要以丹酚酸A、B、C、D、E最為常見[3]。而且現代藥理學研究表明，這些丹酚酸化合物具有明顯的生物活性，尤其是丹酚酸B的生活性研究的最為廣泛且深入。其明顯具有抗心血管疾病[4]、抗動脈粥樣硬化[5]、治療糖尿病[6]、抗炎、抗氧化等藥理活性[7]。另一類是以丹參酮（Tanshinone）為代表的脂溶性成分[2,8,9]，主要以丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I、二氫丹參酮I 最為常見。藥理活性研究表明，丹參酮具有明顯的生物活性，主要表現在抗炎[10]、抗腫瘤[11]、抗動脈粥樣硬化[12]、治療心血管疾病[13]等。三萜類成分如莫里斯酸、烏蘇酸等在唇形科鼠尾草屬植物中早已被分離得到[14]。其藥理活性亦有很多報道，主要體現在三萜酸對抗氧化、抗菌、抗腫瘤等方面的生物活性[14]，對三萜酸抗炎活性研究報道很少。因此，本實驗主要是對丹參中三萜酸一類化學成分分離及其抗炎活性進行研究。結果表明，我們分離得到7 個三萜酸（圖1），他們都屬于本植物首次分離得到。抗炎活性研究表明，他們都具有良好的抗炎活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

半制備島津高效液相色譜儀（LC-20AB，SPD-20A，日本島津公司）；C18分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國kromasil公司）；CPA225D Sartotius電子天平（上海中殷醫療設備有限公司）；核磁共振儀（TMS 內標，Bruker AVANCE III600 型，德國布魯克公司）；中壓柱色譜（填料為ODS，瑞士Buchi公司）；CO2培養箱（美國Thermo 公司）；Biotek Synergy H1 酶標儀（美國博騰公司）；梅特勒-托利多電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 材料

化學試劑（分析純及色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；氘代試劑（德國Merck 公司）；多功能酶標儀（美國Biotek 公司）；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、Greiss 試劑（美國Sigma 公司）；胎牛血清（FBS）及高糖培養基（DMEM）（美國Gibco 公司）；TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒（中國深圳欣博盛公司）；RAW264.7細胞（美國ATCC）。丹參藥材購自安徽亳州藥材市場，經蘇州大學藥學院李笑然教授鑒定為丹參，藥材標本保存于蘇州大學藥學院標本室（No.20151009-1）。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

將50 kg干燥丹參飲片用95%乙醇（100 L）加熱回流提取兩次，減壓濃縮至無醇味。分別用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮得到二氯甲烷部位濃縮液（5.2 kg），乙酸乙酯濃縮液（3.8 kg），正丁醇濃縮液（6.3 kg）。將二氯甲烷部位濃縮液（5.2 kg）經減壓硅膠柱色譜（200-300目），石油醚-乙酸乙酯（9∶1，6∶1，3∶1，1∶1，0∶1）梯度洗脫得到五個部位Fr.1-Fr.5，合并Fr.3和Fr.4兩個部位。將合并的部分樣品用純甲醇溶解，用中壓色譜（MPLC）連接ODS 反相色譜柱分離，甲醇-水（1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1）梯度洗脫，并結合SephadexLH-20凝膠色譜及半制備高效液相色譜（HPLC）進一步分離，分離得到化合物1（45.6 mg），2（52.9 mg），3（62.3 mg），4（42.6 mg），5（39.1 mg），6（26.1 mg），7（51.0 mg）。并且這7個化合物都是從該植物中首次分離得到。

2.2 Greiss試劑檢測化合物對NO釋放的影響

將RAW264.7小鼠單核巨噬細胞培養在含有10%胎牛血清（FBS）高糖培養基（DMEM）中，放在含有5%CO2溫度為37℃培養箱中進行培養。將2×104RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞種在96 孔板中，然后將其培養在CO2培養箱過夜，用不同濃度的化合物（60,30,15 μM）預處理細胞1 h后，加入LPS（1 μg·mL-1）共培養16 h，取上清液（80 μL）與Griess 試劑（80 μL）混合，在CO2培養箱避光孵育15 min，用酶標儀波長為540 nm檢測吸光度值。

2.3 ELISA方法檢測TNF-α和IL-6

將2×105RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞種在24 孔板中，然后將其培養在CO2培養箱過夜，用不同濃度的化合物（60，30，15 μM）預處理細胞1 h 后，加入LPS（1 μg·mL-1）共培養16 h，取上清液，按照酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒說明書，檢測化合物對炎癥因子：腫瘤壞死因子（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的釋放情況。

2.4 數據統計處理

應用Graphpad Prism 6.0 軟件中的單因素方差分析（One way-ANOVA）對實驗結果進行比較分析，所有藥理實驗至少重復3次。

3 實驗結果

3.1 結構鑒定

化合物1：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.96（1H，m，H-2），3.48（1H，m，H-3），5.28（1H，s，H-12），2.25（1H，d，J=11.4 Hz，H-18），0.97（3H，s，H-23），0.87（3H，s，H-24），0.77（3H，s，H-25），0.97（3H，s，H-26），1.17（3H，s，H-27），0.80（3H，s，H-29），0.88（3H，s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：42.1（C-1），66.6（C-2），79.1（C-3），38.6（C-4），48.3（C-5），18.7（C-6），33.2（C-7），39.8（C-8），47.6（C-9），38.7（C-10），23.8（C-11），125.7（C-12），138.6（C-13），41.3（C-14），28.6（C-15），24.4（C-16），47.5（C-17），53.2（C-18），39.7（C-19），39.5（C-20），30.4（C-21），37.3（C-22），28.9（C-23），22.5（C-24），16.9（C-25），17.4（C-26），23.9（C-27），181.1（C-28），17.2（C-29），21.6（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid[15]。

化合物2：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.45（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），4.26（1H，m，H-2），5.49（1H，br，s，H-12），1.28（3H，s，H-23），1.02（3H，s，H-24），1.06（3H，s，H-25），1.08（3H，s，H-26），0.98（3H，s，H-29）1.22（3H，s，H-27），0.95（3H，s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：47.9（C-1），69.0（C-2），83.4（C-3），39.6（C-4），55.9（C-5），18.2（C-6），33.8（C-7），48.8（C-8），48.7（C-9），38.9（C-10），23.9（C-11），122.6（C-12），144.3（C-13），42.8（C-14），28.8（C-15），24.2（C-16），46.9（C-17），42.3（C-19），31.5（C-20），34.8（C-21），33.9（C-22），29.8（C-23），17.5（C-24），17.8（C-25），17.9（C-26），26.5（C-27），180.1（C-28），33.9（C-29），24.2（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為Maslinic acid[16]。

化合物3：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.48（1H，d，J=9.8 Hz，H-3），4.29（1H，m，H-2），5.62（1H，br，s，H-21）1.00（3H，s，H-23），1.09（3H，s，H-24），1.32（3H，s,H-25），1.78（3H，s,H-26），1.06（3H，s，H-27），0.77(3H，d，J=6.4 Hz，H-29)，0.88（3H，d，J=6.0 Hz，H-30）。13C-NMR（125 MHz）δ：48.9（C-1），69.7（C-2），84.3（C-3），39.4（C-4），56.7（C-5），19.6（C-6），35.6（C-7），41.3（C-8），51.8（C-9），39.7（C-10），22.7（C-11），33.2（C-12），40.6（C-13），42.8（C-14），28.9（C-15），30.8（C-16），49.8（C-17），49.1（C-18），38.8（C-19），143.9（C-20），118.6（C-21），38.5（C-22），29.1（C-23），17.6（C-24），18.8（C-25），16.1（C-26），15.3（C-27），178.7（C-28），23.2（C-29），22.5（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為Psiguanin A[17]。

化合物4：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.50（1H，m，H-2），2.89（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.10（1H，br，s，H-12），0.86（3H，s，H-23），0.78（3H，s，H-24），0.79（3H，s，H-25），0.95（3H，s，H-26），1.02（3H，s，H-27），0.78（3H，d，J=6.4 Hz，H-29），0.88（3H，d，J=6.0Hz，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：48.1（C-1），69.9（C-2），80.9（C-3），40.8（C-4），56.0（C-5），19.9（C-6），34.6（C-7），41.2（C-8），49.2（C-9），39.5（C-10），24.7（C-11），126.9（C-12），139.1（C-13），43.8（C-14），29.8（C-15），25.6（C-16），48.0（C-17），54.7（C-18），40.0（C-19），40.9（C-20），32.2（C-21），38.7（C-22），29.9（C-23），17.9（C-24），17,1（C-25），17.4（C-26），24.8（C-27），180.6（C-28），17.6（C-29），21.3（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid[18]。

表1 三萜酸抑制LPS刺激RAW264.7細胞NO釋放

化合物5：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.45（1H，m，H-2），2.96（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.15（1H，br，s，H-12），0.89（3H，s，H-23），0.85（3H，s，H-24），0.85（3H，s，H-25），0.99（3H，s，H-26），1.05（3H，s，H-27），0.82（3H，d，J=6.4Hz，H-29），0.92（3H，d，J=6.0Hz，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：48.6（C-1），70.2（C-2），80.5（C-3），41.2（C-4），56.5（C-5），19.4（C-6），34.8（C-7），41.4（C-8），49.7（C-9），40.0（C-10），24.9（C-11），125.9（C-12），139.6（C-13），43.2（C-14），29.2（C-15），25.1（C-16），48.2（C-17），54.4（C-18），40.2（C-19），41.2（C-20），32.7（C-21），38.2（C-22），30.0（C-23），17.2（C-24），17,5（C-25），17.3（C-26），24.1（C-27），180.2（C-28），17.9（C-29），21.7（C-30）。其1H-NMR 和13C-NMR 數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為2α-hydroxy ursolic acid[19,20]。

化合物6：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.52（1H，m，H-2），3.12（1H，d，J=9.0 Hz，H-3），5.65（1H，br，s，H-12），0.94（3H，s，H-23），0.93（3H，s，H-24），0.95（3H，s，H-25），0.99（3H，s，H-26），1.10（3H，s，H-27），1.25（3H，d，J=7.8 Hz，H-29），5.82（1H，br，s，H-30），5.94（1H，br，s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：47.1（C-1），70.8（C-2），80.9（C-3），41.5（C-4），56.7（C-5），19.9（C-6），34.1（C-7），41.9（C-8），50.1（C-9），40.6（C-10），25.5（C-11），126.3（C-12），139.1（C-13），43.8（C-14），29.6（C-15），25.8（C-16），48.5（C-17），54.8（C-18），39.1（C-19），154.8（C-20），31.7（C-21），38.6（C-22），16.9（C-23），17.8（C-24），17.9（C-25），17.8（C-26），24.5（C-27），178.9（C-28），18.1（C-29），105.4（C-30）。其1H-NMR 和13C-NMR 數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為2α,3αdihydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid[18]。

化合物7：白色無定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.58（1H，m，H-2），3.12（1H，d，J=9.8 Hz，H-3），5.65（1H，br，s，H-12），3.67（1H，d，J =13.8 Hz，H-23），3.52（1H，d，J = 13.8 Hz，H-23），0.91（3H，s，H-24），0.96（3H，s，H-25），1.02（3H，s，H-26），1.12（3H，s，H-27），1.20（3H，d，J=7.8 Hz，H-29），5.78（1H，br s，H-30），5.82（1H，br s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：49.3（C-1），71.5（C-2），81.5（C-3），41.8（C-4），56.9（C-5），19.9（C-6），34.1（C-7），41.0（C-8），49.2（C-9），40.4（C-10），24.1（C-11），125.0（C-12），140.2（C-13），43.0（C-14），29.9（C-15），25.7（C-16），48.8（C-17），54.8（C-18），40.8（C-19），153.6（C-20），32.1（C-21），38.8（C-22），71.9（C-23），17.8（C-24），17.0（C-25），17.8（C-26），24.2（C-27），180.8（C-28），17.1（C-29），104.9（C-30）。其1H-NMR 和13C-NMR 數據與文獻報道的數據基本一致，故鑒定其為2α,3αdihydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid[21]。

3.2 化合物對NO釋放情況測定

從實驗結果中，我們發現7 個三萜酸都具有較好的抑制NO釋放作用（表1）。由于7個化合物的化學結構式非常相似，所以他們體現出的抑制NO 釋放的活性基本一致，沒有明顯的差異性，也沒有體現出一定的構效關系。

3.3 化合物對炎癥因子TNF-α和IL-6釋情況測定

從實驗結果中，我們發現7 個化合物在高濃度的情況具有較好的抑制炎癥因子TNF-α及IL-6 的釋放（圖2）。7個化合物在高劑量時（60 μM）對TNF-α及IL-6的釋放具有明顯的抑制作用，在中劑量時（30 μM）體現出一定的活性，但是不明顯，低劑量（15 μM）幾乎沒有活性。

4 討論

丹參作為一味常見的活血化瘀類中藥，具有悠久的中醫臨床應用歷史。目前，以關鍵詞“Danshen”或“丹參”在PubMed 或CNKI 分別搜到2 975 篇和48 998篇文章，可見國內外學者對丹參研究的非常廣泛且深入。有很多研究顯示，丹參具有很明顯的抗炎活性[22,23]，尤其是丹酚酸和丹參酮抗炎效果及機制非常明確。丹酚酸和總丹參酮對各種炎癥模型的動物都一定治療作用，如組織胺造模的血管通透性增加大鼠，蛋清、角叉菜膠或右旋糖酐造模的關節炎腫痛的大鼠，巴豆油、二甲苯造模耳腫脹的小鼠等[7]。其作用機制是通過調節NF-κB信號通路及MAPK信號通路，達到抑制溶酶體、炎癥因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，NO，PGE2 等）釋放及中性粒細胞趨化性，起到減少炎癥滲出效果，從而達到抗炎效果[24]。本研究采用ELISA 方法檢測了7 個三萜酸對炎癥因子TNF-α和IL-6 的影響。結果顯示，7 個三萜酸都具有很好抑制炎癥因子釋放的作用。此外，本研究還采用Griess 試劑檢測NO 釋放，NO 在機體內極不穩定，容易生成NO2-，NO2-與Griess 試劑發生反應生成重氮化合物[25]。因此，重氮化合物與NO成一定的線性關系，從而反應了NO 的含量。NO 的生成主要是由一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）的作用下催化L-精氨酸生成的[26,27]。NOS 有三種形式eNOS、nNOS、iNOS。其中，eNOS主要調控內皮細胞生成NO，參與血管功能調控；nNOS 在神經系統中調控NO 產生，參與細胞通訊及信息存儲；iNOS 在誘導情況下產生NO，參與機體免疫與抗炎反應等[26,27]。但是，本研究只是檢測NO 釋放情況，相關的iNOS 的活性及表達則沒有進一步研究。綜上所述，本研究從丹參中分離鑒定了7個三萜酸，其中4個屬于本植物首次分離，豐富了丹參中的化學成分種類。此外，本研究初步探索了三萜酸抗炎活性，證實了7 個三萜酸都具有一定的抗炎活性，初步闡述了丹參發揮抗炎作用物質基礎，但是，其作用機制還需要進一步深入探索。