中風病急性期痰熱證與MMP-2 表達的影響＊

郭春莉，付 強，高 穎

（1.中國中醫科學院西苑醫院 北京 100091；2.中國標準化研究院 北京 100191；

3.北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100700）

中風病是嚴重危害人類健康的常見病，具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高的特點，已成為我國農村和城市人口第一位致殘和死亡的原因[1]。臨床證據表明，中藥對缺血性卒中治療有效，其主要是通過干預證候達到改善或治療疾病，臨床研究提示，中風急性期約有40%-50%的病人表現出痰熱證，中醫藥對中風病急性期痰熱證的治療也突顯優勢，MMP-2在血清中的含量可以反應神經細胞的壞死程度，也可以反映神經細胞周圍的濃度，也對判斷治療效果有一定幫助。MMP-2與中風病急性期痰熱證是否存在相關性，其相關性研究能否形成微觀辨證的依據，以及能否成為證候診斷及療效評價的依據對中醫藥治療中風病具有重要的意義。

1 研究資料和方法

1.1 臨床資料

本研究數據來源于2013 年8 月-2015 年5 月發病7天內就診于中國中醫科學院西苑醫院的缺血性中風痰熱證患者45 名，非痰熱證44 名，發病年齡均為35歲-85歲。

1.2 篩選中風病急性期受試者

1.2.1 疾病診斷

疾病診斷標準參照2005年衛生部疾病控制司、中華醫學會神經病學分會頒布的《中國腦血管病防治指南（試行版）》的腦梗塞診斷部分。

1.2.2 證候診斷

證候診斷標準參照973 計劃“缺血性中風病證結合的診斷標準與療效評價體系研究”課題組制定的《缺血性中風證候要素診斷量表》。

1.2.3 納入標準

符合疾病診斷標準；起病7天以內；年齡≥35歲且≤85歲者。

1.2.4 排除標準

蛛網膜下腔出血者；年齡小于35 歲或大于85 歲者；病程超過1 周的急性腦血管病患者；既往有腫瘤、造血系統疾病者；有精神性疾病患者；不配合者；資料不全影響結果判定者。

1.3 臨床信息采集

所有入選受試者均填寫統一表格，表格內容主要是人口學資料（指調查患者的個人信息，包括患者姓名、性別、出生日期、家庭住址、聯系電話等）、病史調查（既往史、家族史、過敏史、生命體征、一般內科情況、神經系統檢查等），中風病急性期受試者并填寫病例觀察表、中風病證候要素診斷量表，分為痰熱組和非痰熱組，均于入院后第1日清晨空腹取血，采用酶聯免疫吸附法測定血清MMP-2水平。

1.4 研究方法

1.4.1 證候量化評定

經過統一組織的量表使用培訓后，由納入之日由腦病科醫師使用《缺血性中風證候要素診斷量表》，對每例患者分別作出內風證、內火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10分診斷成立）。

1.4.2 受試者血清MMP-2的測定

在缺血性中風病起病第7 d采肘靜脈血10 mL，留取標本后盡快注入EDTA 抗凝管內，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA 法），檢測血清中MMP-2的含量（ng·mL-1）。具體操作步驟如下：

1）標準品的稀釋與加樣：標準品按照說明書稀釋好五個梯度，各個梯度每孔加樣量都為50 μL，

2）加樣：分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

4）配液洗滌：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5次，拍干。

5）加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。6）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。7）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。

8）顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。

9）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應。

10）測定：以空白空調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 min 以內進行。（主波長450，輔助波長630）

1.5 統計學方法

應用SPSS 17.0版本，組內數據分析采取獨立樣本t檢驗，組間分析采取單向方差分析的方法。

2 研究結果

研究結果顯示，痰熱組MMP-2的表達較非痰熱組MMP-2表達增強，具有統計學意義。

3 討論

中藥對缺血性卒中治療有效，主要是通過干預證候達到改善或治療疾病，因此證候的規范化研究一直是中風病診療研究的重點和難點。

“辨證論治”被認為是中醫學術思想的精髓，已經成為指導中醫臨床診斷和治療的基礎。1955年，任應秋先生發表了《中醫的辨證論治的體系》的一文，首次明確提出“辨證論治”這個概念，“辨證論治是中醫臨床上不可缺少的基本知識，所以張仲景的傷寒論和金匱要略兩書數十篇，無一篇不貫以病脈證并治或病脈證治的題目，但中醫的證候決不同于西醫的癥狀，中醫的證候完全是施治用藥的標準，而西醫的癥狀，不過是描寫病人的異常狀態，殊非診斷治療上的關鍵；中醫的辨證論治，注意于生體病變的全身證候，務使生體的生活機能恢復其正常狀態，也就是說要把病證整個病理機轉一變而為生理機轉。”[“2]辨證”就是對病人四診所收集的臨床信息進行概括、判斷為某種證候，是論治的前提和依據，“論治”是根據辨的證候來確定治法和處方譴藥，因此“證候”是連接中醫學理論和臨床研究的核心與關鍵問題。傳統中醫只能依靠望、聞、問、切來獲取患者的臨床信息等病情資料，臨床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集過程中主觀性很大，而且受到個人師承、臨床經驗、認知水平和方法及不同時代的不同，導致辨出的證候差別很大，使得辨證的精確性和重復性較差，影響了研究結論的真實性和可靠性，而且證候的概念模糊不清，表現出對證候名稱及其內涵描述的經驗化和隨意性。證候與病名、癥狀等術語的劃分不嚴格，稱謂的繁雜，內容交錯，隨意性較大，缺乏統一的標準。中醫證候描述的不確定性和缺乏規范性，這使中醫學在現代社會中的應用與發展受到了很大的制約，不利于中西醫理論與臨床的相互溝通與交叉滲透，不利于自身的學術交流與對外交流。另外，在療效評價方面，證候的療效評價也起到了至關重要的作用，一些專家認為不對證候療效評價，就是失去了中醫的特色和優勢，將會使中醫辨證論治個體化治療的優勢得到削弱。如劉鳳斌等認為“證”是中醫診斷與療效評價的核心所在，撇開“證”的改善，完全用西醫的指標體系評價中醫的療效，無異于本末倒置，不利于中醫藥的發展[3]。因此，辨證論治的核心地位的確立，對證候規范化提出了新的需求。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是降解細胞外基質的蛋白酶類之一，其編碼基因具有同源性，依據基質金屬蛋白酶受體(MMPR)的組織特異性不同可分為：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 等等。MMP-2 作為MMPs 經典成員，可由機體內多種細胞分泌，活化后可以有效地降解Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白，也對細胞和組織的修復及傷口的愈合有重要影響[4]。MMP-2還具有調節凝血因子和補體的作用，當其表達升高同時，可以引起機體的纖維蛋白溶解系統的機制失調，使腦血管病的發生率升高。因此，MMP-2在血清中的含量可以反應神經細胞的壞死程度，也可以反映神經細胞周圍的濃度，也對判斷治療效果有一定幫助。

臨床研究提示，中風急性期約有40%-50%的病人表現出痰熱證，痰為氣血津液代謝紊亂的產物，為有形之邪，具有黏稠重濁之性，易與火熱相結，二者交結難解，不易變化。便秘便干、舌苔黃膩、脈弦滑構成中風病急性期痰熱證的基本證候特征及辨證要點[5]。王永炎院士指出中風病急性期病機錯綜復雜，證候變化多端，病勢發展迅猛，難以駕馭，且變證壞證頻見，極易產生神昏、竅閉、厥脫等，為難治重證，提出了“毒損腦絡”中風病機理論的觀點。中醫藥對中風病急性期痰熱證的治療也突顯優勢。

大量臨床實踐證明痰熱證是中風病急性期的常見證候，痰熱證的證候演變特點及其與神經功能缺損程度密切相關，中醫藥主要是通過干預中風病痰熱證證候因素以改善癥狀或治療疾病。本研究結合前期研究的基礎上，以王永炎院士提出的“證候概念及其屬性”理論為依據，以痰熱證與基質金屬蛋白酶相關亞型的關系為切入點，發現中風病急性期痰熱證的MMP-2的表達明顯增高，其相關性研究可以形成微觀辨證的依據，其成為證候診斷及療效評價的依據對中醫藥治療中風病具有重要的意義。但該研究受樣本量小的局限，試驗結論可能存在一定的誤差，今后可以擴大樣本量、并增加對MMPs諸多亞型的進一步研究，為循證醫學研究提供更加客觀的數據支持。

通過總結分析MMP-2 與中風病證候之間的相關性分析，為證候的規范化研究奠定了基礎。這些研究成果對實施中醫藥標準化戰略，加快構建中醫藥標準體系，提高中醫藥科技競爭力，促進中醫藥資源發揮更大社會經濟效益具有重要意義，具有良好的推廣應用前景，在做好研究工作的同時，推廣研究產出的各項方法和技術，使得研究成果與中醫藥標準化實踐緊密結合起來，充分發揮科研對實踐工作的指導作用，真正實現科研與實際工作的相互促進。