葫蘆素片對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝病的預(yù)防作用

黃邀 吳惠蘭 肖銘澍

兒童非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在兒童無(wú)飲酒的情況下出現(xiàn)的以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)堆積為特征的臨床綜合征。流行病學(xué)調(diào)查顯示兒童NAFLD的發(fā)病率為9.6%，肥胖兒童甚至高達(dá)38%，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康[1]。至今，兒童NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，加上兒童年齡的特殊性，藥物的不良反應(yīng)比較多，不主張應(yīng)用成人的減肥方法治療兒童肥胖癥和非酒精性脂肪肝，故干預(yù)其生活方式（控制飲食+運(yùn)動(dòng)）被認(rèn)為是治療該病的關(guān)鍵。

葫蘆素片是一種傳統(tǒng)的護(hù)肝中藥，主要用于在慢性肝炎及原發(fā)性肝癌的治療，其作用機(jī)制是可以逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞免疫損傷，阻止其脂肪變性，抑制肝纖維增生，從而消退黃疸并降低肝酶[2]。本研究采用葫蘆素片治療NAFLD模型大鼠，觀察干預(yù)前后大鼠血清酶學(xué)、脂代謝、胰島素抵抗等指標(biāo)及肝臟的病理學(xué)改變等，探討葫蘆素片對(duì)大鼠NAFLD的預(yù)防作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康的雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量 160～190g，鼠齡 4～6周，按4只/籠的密度進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20～26℃，設(shè)定明暗周期為12h（上午8：00～下午 8：00），先進(jìn)行 1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，早晨定時(shí)定量投食，按需飲水，觀察大鼠攝食情況的變化。

1.2 試劑與設(shè)備 葫蘆素片（天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z12020128，規(guī)格：0.1mg×10s×3板），大鼠胰島素試劑盒（ELISA 法）(美國(guó)R＆D公司分裝BM-E30093)，游離脂肪酸試劑盒（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社），全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司AU5800）。

1.3 分組與建模方法 將大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：Ⅰ組（普通飲食組）、Ⅱ組（高脂飲食組）和Ⅲ組（葫蘆素片干預(yù)組，高脂飲食+葫蘆素片），每組12只。大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，Ⅰ組給予普通飼料。Ⅱ組給予高脂飼料（普通飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇[3]，喂養(yǎng)10周建立NAFLD動(dòng)物模型）。Ⅲ組給予高脂飼料同時(shí)給予葫蘆素片灌胃，劑量為0.1 mg/次 (溶于2ml氯化鈉溶液)，2次/d，Ⅱ組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天上午9:00和下午3:00左右灌胃。3組大鼠喂養(yǎng)10周，每周定時(shí)稱體重1次，飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)處死（飼養(yǎng)過(guò)程中均無(wú)死亡）。

1.4 血清指標(biāo)、肝重及肝指數(shù)測(cè)定 所有大鼠處死前夜禁食達(dá)到空腹?fàn)顟B(tài)，次日測(cè)量體重后，予2%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血后頸椎脫臼處死，測(cè)定血ALT、AST、TG、膽固醇（CHO）、脂蛋白 a（LPa）、LDL、HDL、游離脂肪酸（FFA）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、胞漿型磷脂酶 A2（cPLA2）、分泌型磷脂酶 A2（sPLA2）、鈣非依賴性磷脂酶A2（iPLA2）等指標(biāo)，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）＝（FINS×FPG）/22.5，胰島素敏感指數(shù)（IAI）＝1/（FINS×FPG）。稱取肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)，肝指數(shù)＝肝濕重/體重，取10g肝組織液氮速凍后保存于-80℃冰箱待檢測(cè)肝脂質(zhì)，取肝右葉中部10g肝組織，以10%甲醛固定后用于病理學(xué)檢查或以戊二醛-鋨酸固定后用于電鏡檢查。

1.5 肝脂質(zhì)測(cè)定 按100g肝組織：1ml Fovch溶劑（氯仿：甲醇體積比為2∶1配制）比例處理后，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定標(biāo)本CHO、TG含量，計(jì)算肝脂質(zhì)，以mg/g肝組織表示。

1.6 肝臟病理學(xué)檢查 病理學(xué)診斷參照2005年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南，常規(guī)進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度計(jì)分的脂肪變性計(jì)分（肝實(shí)質(zhì)脂肪變性的范圍與評(píng)分：＜5%為0分，5%～33%為1分，33%～66%為2分，＞66%為3分）[4]，炎癥活動(dòng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)則參考1981年Knodell等[5]提出的慢性肝炎組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)（肝門(mén)區(qū)無(wú)炎癥為0分，肝門(mén)區(qū)輕度炎癥為1分，肝門(mén)區(qū)中度炎癥為3分，肝門(mén)區(qū)顯著的炎癥為4分）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料先開(kāi)平方根轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布資料，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體重、肝重、肝指數(shù)比較 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Ⅱ組大鼠體重、肝重、肝指數(shù)均高于Ⅰ組，Ⅲ組大鼠肝重、肝指數(shù)均高于Ⅰ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠體重、肝重、肝指數(shù)比較

2.2 3組大鼠病理學(xué)檢查所見(jiàn)比較

2.2.1 肝臟大體改變 3組大鼠肝臟的顏色、邊緣、體積相比有明顯差異，Ⅰ組大鼠肝臟呈紅褐色，邊緣銳利，質(zhì)地軟而富有彈性。Ⅱ組大鼠肝臟體積明顯增大，邊緣鈍而厚，表面光滑，表面及切面均呈黃色，油膩感明顯。與Ⅱ組相比，Ⅲ組肝臟的體積略增大，邊緣稍鈍，表面及切面亦呈黃色，但油膩感不如Ⅱ組，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

2.2.2 光鏡下肝組織改變 HE染色下3組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)、肝索、肝竇及匯管區(qū)結(jié)構(gòu)及脂肪變性程度均有明顯差異，Ⅰ組肝索結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞形態(tài)正常，匯管區(qū)和中央靜脈結(jié)構(gòu)清楚，肝血竇內(nèi)少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Ⅱ組肝細(xì)胞存在彌漫性大泡性脂肪變性，伴有氣球樣變性，肝小葉內(nèi)見(jiàn)到點(diǎn)灶狀壞死，灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇受擠壓變窄。Ⅲ組肝細(xì)胞存在廣泛的大泡性脂肪變性，與Ⅱ組差異不明顯，肝小葉內(nèi)見(jiàn)到散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。

圖1 3組大鼠肝臟大體改變（a：Ⅰ組；b：Ⅱ組；c：Ⅲ組）

圖 2 3 組大鼠光鏡下肝組織改變（a：Ⅰ組；b：Ⅱ組；c：Ⅲ組，HE 染色，×200）

2.2.3 電鏡下肝組織改變 3組大鼠肝細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變化有明顯差異，Ⅰ組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清楚。Ⅱ組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹明顯，線粒體脊結(jié)構(gòu)模糊不清，見(jiàn)到多量脂滴堆積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹明顯，表面顆粒脫落。Ⅲ組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體高度腫脹，線粒體脊模糊不清，可見(jiàn)脂滴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，表面顆粒脫落，與Ⅱ組差異不明顯，見(jiàn)圖3。

圖 3 3 組大鼠電鏡下肝組織改變（a：Ⅰ組；b：Ⅱ組；c：Ⅲ組，透射電鏡，×40 000）

2.3 3組大鼠肝功能、血脂等指標(biāo)的比較 Ⅱ、Ⅲ組ALT、TG、CHO、LPa、LDL 均高于Ⅰ組，Ⅲ組 ALT 低于Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 3組大鼠血糖及胰島素抵抗指標(biāo)的比較 Ⅱ、Ⅲ組FINS均高于Ⅰ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 3組大鼠血清生化指標(biāo)的比較

表3 3組大鼠血糖及胰島素抵抗指標(biāo)的比較

2.5 3組大鼠肝臟脂質(zhì)、脂肪變性及炎癥活動(dòng)度比較 Ⅱ、Ⅲ組TG、CHO均高于Ⅰ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Ⅱ、Ⅲ組肝臟脂肪變性程度較Ⅰ組嚴(yán)重，Ⅱ組炎癥活動(dòng)度較Ⅰ組嚴(yán)重，Ⅲ組炎癥活動(dòng)度較Ⅱ組輕，見(jiàn)表4。

2.6 3組大鼠FFA、LPC及PLA2水平比較 Ⅱ、Ⅲ組FFA、LPC、sPLA2水平高于 I組，Ⅲ組 LPC、sPLA2水平低于Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），各組cPLA2、iPLA2水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05），見(jiàn)表 5。

表4 3組大鼠肝臟脂質(zhì)、脂肪變性及炎癥活動(dòng)度比較（mg/g）

表5 3組大鼠血清FFA、LPC及PLA2水平比較

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，是由多種病因引起的脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積過(guò)多導(dǎo)致的臨床病理綜合征，不論對(duì)成人還是兒童的健康都會(huì)造成很大的影響。資料表明近10年內(nèi)NAFLD呈現(xiàn)低齡化的趨勢(shì)，以肥胖兒童更為突出，國(guó)內(nèi)報(bào)道肥胖兒童和青少年中NAFLD的檢出率高達(dá)23.33%～59.57%，明顯高于國(guó)外，這與近幾年肥胖兒童增加、肥胖程度加重都有關(guān)[6]。本研究顯示Ⅱ組的大鼠體重和肝重明顯超過(guò)Ⅰ組，形成并達(dá)到肥胖水平，同時(shí)該組大鼠肝脂質(zhì)超過(guò)Ⅰ組大鼠，肝細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重，形成非酒精性脂肪肝。

NAFLD的病理改變程度不一，可以從單純的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），伴或不伴有肝纖維化，最后發(fā)展為肝硬化、甚至肝細(xì)胞癌。肝活檢病理分析是區(qū)分單純脂肪變性和NASH最明確的方法，而且可同時(shí)進(jìn)行疾病嚴(yán)重程度分級(jí)，但是作為一項(xiàng)有創(chuàng)操作，肝活檢并不能被所有NAFLD的患兒及家長(zhǎng)所接受。ALT是兒童代謝綜合征的一個(gè)生化指標(biāo)，脂肪肝患兒常有該酶水平的升高，年齡≥10歲的超重和肥胖兒童ALT≥80U/L診斷NAFLD靈敏度為57%，特異度為71%[7]，故本研究團(tuán)隊(duì)有必要對(duì)肥胖及超重合并高危因素的患兒常規(guī)進(jìn)行肝功能篩查。葫蘆素是一種從葫蘆科及其他科屬多種植物中提取的苦味苷元成分，具有多種生物活性，可以起到保肝、降酶、退黃的作用。研究表明，葫蘆素片能提高血漿cAMP水平、調(diào)節(jié)肝蛋白濃度，增加cAMP/cGMP比，改善受損肝細(xì)胞的ALT異常，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)閉[8]。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飲食構(gòu)建大鼠NAFLD的動(dòng)物模型，檢測(cè)大鼠體重、肝重和肝臟的組織病理、血ALT、AST、FINS、HOMA-IR、IAI、FFA、TG、CHO、LDL、LPa等，發(fā)現(xiàn)經(jīng)葫蘆素片干預(yù)能明顯降低NAFLD大鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，減輕干細(xì)胞的炎性病變程度，也能一定程度地降低血清TG、FFA、LPC、sPLA2水平，改善胰島素抵抗。這提示筆者早期給予葫蘆素片干預(yù)可以降低大鼠的血脂和肝脂質(zhì)，減輕肝細(xì)胞炎性病變程度，對(duì)NAFLD的發(fā)生起到一定的預(yù)防作用。