南方紅豆杉水提物對NCI-N87胃癌裸鼠移植瘤凋亡作用及機制研究

鄒媛媛 王亞坤 裴靜波

[摘要] 目的 探討南方紅豆杉水提物對HER2陽性人胃癌NCI-N87細胞裸鼠移植瘤的誘導凋亡作用，并初步探索其作用機制。 方法 建立荷瘤裸鼠模型，將60只BALB/c裸鼠接種人HER2陽性胃癌NCI-N87細胞株并隨機分組給藥及取瘤，TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡，實時熒光定量PCR法檢測PI3K、AKT1、mTOR mRNA表達水平。結果 ①中藥低、中、高劑量組均可見到凋亡細胞，凋亡率同對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;中劑量聯合組差異性最為顯著（P<0.01）;②紅豆杉各劑量組PI3K mRNA表達均降低（P<0.05），紅豆杉聯合赫賽汀后明顯下調AKT1 mRNA表達，紅豆杉中、低劑量組mTOR mRNA表達顯著降低（P<0.05）。 結論 ①南方紅豆杉水提物可以誘導胃癌細胞的凋亡，聯合西藥曲妥珠單抗后并未增強其誘導作用;②南方紅豆杉水提物可部分下調PI3K、AKT1、mTOR mRNA表達水平。

[關鍵詞] 南方紅豆杉水提物;胃癌;凋亡;PI3K/AKT/mTOR

[中圖分類號] R730.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）08-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis effect of aqueous extract of Taxus Chinensis Var. Mairei on the transplanted tumor of nude mide with HER2-positive human gastric cancer NCI-N87 cells， and to preliminarily explore its mechanism. Methods A model of tumor-bearing nude mice was established. 60 BALB/c nude mice were inoculated into human HER2-positive gastric cancer NCI-N87 cell line and randomLy grouped for administration and tumor-removing. TUNEL assay was used to detect the apoptosis of transplanted tumor cells. The expression levels of PI3K， AKT1 and mTOR mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. Results ①Apoptotic cells were observed in the low， medium and high dose groups of Chinese medicine， and the apoptosis rate was compared with the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）; the difference in the combined middle dose group was the most significant（P<0.01）; ②The expression of PI3K mRNA in each dose group of Taxus was decreased（P<0.05）. After Taxus combined with Herceptin， the expression of AKT1 mRNA was down-regulated significantly. The expression of mTOR mRNA in the middle and low dose groups of Taxus was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion ①The aqueous extract of Taxus Chinensis Var. Mairei can induce apoptosis of gastric cancer cells. Its combination with Western medicine of trastuzumab does not enhance the induction;②The aqueous extract of Taxus chinensis var. mairei can partially down-regulate the expression levels of PI3K， AKT1 and mTOR mRNA.

[Key words] Aqueous extract of taxus Chinensis var. Mairei; Gastric cancer; Apoptosis; PI3K/AKT/mTOR

胃癌是常見惡性腫瘤之一，發病率居高不下，最近的國家癌癥中心數據顯示，胃癌在男性惡性腫瘤中發病排第2位，女性第5位，預后相對差[1，2]。發表在《柳葉刀》雜志上的全球癌癥生存趨勢監測計劃中，中國胃癌患者的5年生存率雖然從2000～2004年的30.2%提高到2010～2014年的35.9%，卻仍舊只有韓國的一半[3]。

資料表明，有12%～35%胃癌患者HER2基因表達陽性[4，5]，在胃癌的發生中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路的異常激活起著重要的作用[6]，可受HER2調控，PI3K-AKT信號傳導通路異常激活后，可發生腫瘤疾病，并與細胞增殖和凋亡相關[7，8]。現代研究表明，紅豆杉可抑制多種腫瘤細胞的生長，能激活T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞，可以促進白介素1、2，TNF-α，干擾素等的合成，以及調節抗體和補體而明顯改善免疫功能[9]。南方紅豆杉作為中藥飲片在臨床上已廣泛運用，有效并且安全，療效明確。根據前期南方紅豆杉水提物對腫瘤細胞增殖抑制作用的研究[10]，現將體外實驗延伸到體內實驗，通過建立人胃癌HER2陽性裸鼠移植瘤模型，進一步研究南方紅豆杉水提物對HER2陽性胃癌移植瘤的誘導凋亡作用，并探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

南方紅豆杉，規格8 g/包，購置于本院中藥房，由寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司生產，生產批號：100513。80 g南方紅豆杉浸泡過夜，水煎3次后，將藥液混勻經真空抽濾器過濾，電磁爐上濃縮至100 mL，旋轉蒸發儀上濃縮至40 mL，真空干燥箱中干燥，按100%濃度計算得率。曲妥珠單抗（Trastuzumab，赫賽汀，Herceptin），規格440 mg/瓶，上海羅氏制藥有限公司，生產批號：N3586，貯存于2℃～8℃冰箱中。

1.2 實驗動物與細胞株

BALB/c裸鼠60只，4～6周齡，體重18～20 g/只。由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，生產批號：SCXK（滬）2013-0016，在浙江中醫藥大學動物實驗中心特定病原體（SPF）條件下飼養。人NCI-N87胃癌細胞株購自中科院上海生命科學研究院細胞研究所。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 ?用含有10%胎牛血清的RMPI 1640培養液，在37℃、5% CO2飽和濕度條件培養箱內培養，1～2 d更換1次培養液，待細胞長滿培養瓶后，加2 mL 0.25%胰酶-EDTA消化，置于培養箱10～15 min，待細胞全部脫落加培養基終止消化，將細胞懸液移至離心管，800 rpm離心5 min，棄上清液，重懸于細胞培養液中按1：2比例進行傳代，每3～5天傳代一次。

1.3.2 建立模型、分組給藥 ?根據《中藥藥理研究方法學》計算[11]，裸鼠南方紅豆杉低、中、高劑量分別為：成人劑量的5倍：0.520 g/（kg·d），成人劑量的10倍：1.040 g/（kg·d），成人劑量的20倍：2.080 g/（kg·d），灌胃，共給藥3周;用傳統方法煎成湯劑，配制成藥液，使生藥含量分別為52 mg/mL、104 mg/mL、208 mg/mL。根據前期實驗及參考文獻[11]，赫賽汀組首劑按40 mg/kg腹腔注射給藥，每7天一次，后兩次按20 mg/kg給藥，共給藥3次。細胞株取對數生長期的接種于動物左側腋窩下，第7天隨機分組，60只BALB/c裸鼠分為空白組、紅豆杉高劑量組、紅豆杉中劑量組、紅豆杉低劑量組、西藥聯合紅豆杉中劑量組，西藥單藥組，共6組，每組10只。分組后即開始給藥，每次3 mL中藥濃縮液，空白組予同等體積的生理鹽水，共給藥3周，第28天取瘤。

1.4 TUNEL法檢測

各組移植瘤組織4%多聚甲醛常規固定、石蠟包埋、切片，按照表格比例配置TUNEL檢測液，每組切片滴加適量的TUNEL檢測液使其完全覆蓋，濕盒避光孵育60 min，將切片置于PBS或HBSS溶液中室溫浸洗2次，每次5 min，吸干切片上多余的水分，避免干片，滴加0.05 μg/μL的DAPI溶液，室溫濕盒避光孵育10 min，將切片置于PBS或HBSS溶液室溫浸洗3次，每次5 min，用抗熒光猝滅封片劑封片，染色結束后熒光顯微鏡下采集圖像拍片，激發波長范圍450～500 nm，發射波長范圍515～565 nm。

1.5 Real-time PCR檢測

取適量保存在液氮中的移植瘤組織50 mg放入2 mL EP管中進行組織總RNA的提取和純化，再吸取1 μL抽提的RNA進行RNA濃度測定，若OD260/OD280為1.8～2.2之間，證明RNA純度好。引物設計及合成由上海生工公司合成。PI3K（p110α）mRNA上游引物序列為：5-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3，下游引物序列為：5-GGCTACAGTAGTGG-GCTTGG-3，AKT1 mRNA上游引物為：5-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3，下游引物為：5-TTGTAGCCAATA-AAGGTGCCAT-3，mTOR mRNA上游引物為：5-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3，下游引物為：5-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3。各組裸鼠移植瘤組織總RNA的提取和cDNA的合成按試劑說明書操作。

1.6 統計學處理

所有實驗均重復3遍，采用SPSS21.0統計分析軟件進行處理，計量資料數據用（x±s）表示，各組間差異用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL法檢測移植瘤凋亡程度

Herceptin及南方紅豆杉水提物各組對移植瘤均有誘導凋亡作用（表1、圖1、封三圖2）。與對照組比較，紅豆杉各組及西藥組均具有統計學意義（P<0.05），其中中劑量組作用最強，較低、高劑量組作用均更顯著（P<0.01），并未呈現劑量-效應關系;紅豆杉中劑量組與西藥組比較，差異不顯著（P>0.05）;紅豆杉中劑量聯合西藥組與西藥組及紅豆杉各單藥組相比，差異不顯著（P>0.05），紅豆杉低劑量、高劑量組及聯合組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 Real-time PCR檢測PI3K、AKT1、mTOR基因表達

結果顯示（表2、封三圖3）：與對照組相比，各治療組PI3K mRNA表達降低（P<0.05），紅豆杉中劑量組及赫賽汀組PI3K mRNA表達極顯著降低（P<0.01）;紅豆杉單藥組AKT1 mRNA表達差異無統計學意義，紅豆杉中劑量組AKT1 mRNA表達較紅豆杉高、低劑量組顯著降低（P<0.05），紅豆杉聯合赫賽汀組AKT1 mRNA表達顯著降低（P<0.05）;紅豆杉中劑量組mTOR mRNA表達顯著降低（P<0.05），紅豆杉聯合赫賽汀組mTOR mRNA表達極顯著降低（P<0.01）。與赫賽汀組相比，紅豆杉聯合赫賽汀組各基因表達差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

HER2屬于表皮生長因子受體（EGFR）家族，是一種原癌基因，其在組織中基因擴增及過度表達與細胞的癌變及多種惡性腫瘤的預后關系密切。其中曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名Herceptin）是重組的人源化抗HER2的單克隆抗體，能與人HER2胞外受體結合，抑制HER2參與的信號傳導[12，13]，起抑制腫瘤的作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路激活可受HER2調控，HER2能活化PI3K，PI3K進一步催化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2）轉化生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），轉移AKT到達細胞膜內面，在PDK1和mTORC2作用下激活AKT，其是PI3K/AKT通路的主要節點，主要參與調節細胞抗凋亡[14]。活化的AKT進一步激活下游因子，如mTOR，調節細胞周期、凋亡和新生血管生成。AKT的三個亞型有80%以上的氨基酸序列同源性，相似的結構，存在共同結構特征于三個不同的功能區域，三個亞型均參與下游底物的活化[15]，其中AKT1促進細胞存活和增殖并在，并在腫瘤的發生、細胞生長、增殖過程中起重要作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路的阻斷，可以通過抑制此信號通路上的各個靶點，例如siRNA靶向阻斷I型PI3K，從而阻斷PI3K信號通路，導致腫瘤細胞的凋亡[16-18]，還可以通過阻斷AKT通路的激活，進一步抑制其下游信號靶點激活從而導致信號通路的阻斷，達到抑制腫瘤細胞的生長[19，20]。

本實驗結果表明，各治療組均存在細胞的凋亡現象，赫賽汀單藥組也有誘導凋亡作用，紅豆杉水提物的抑瘤作用可以通過誘導凋亡發生，但隨著紅豆杉劑量的增加，并未出現相關濃度依賴性，即隨著藥物濃度的增高其凋亡發生情況并未增多，可以發現中劑量單藥組效果最好，而中劑量聯合西藥組效果并未優于紅豆杉單藥組，也未優于西藥組，為何這樣的一個結果？是否因藥物不同組合后，或采用不同的給藥方式后，腫瘤的發生作用有不同的改變，進而抗瘤機制也隨之發生了相應改變;或者在加入西藥靶向藥物曲妥珠單抗后，腫瘤細胞的生長被阻滯于特定時期，曲妥珠單抗可上調細胞周期蛋白激酶抑制劑p27kip蛋白的表達，誘導細胞周期G1期停滯[21]。而中藥能誘導凋亡作用的信號通路被抑制或者阻滯，相關靶點不能被激活，從而誘導凋亡作用下降。曲妥珠單抗可以有多途徑抑制腫瘤細胞生長，南方紅豆杉作為中藥在運用于腫瘤治療過程中是否影響腫瘤微環境發生改變，加入曲妥珠單抗后其介導免疫應答、抑制血管內皮生長因子、改善細胞膜通透性及阻斷PI3K/AKT信號通路等[22，23]均影響其抑瘤作用，從而產生這樣的結果，具體的深入機制尚需進一步研究。本實驗還從基因角度對其誘導凋亡機制進行了初步探索，實驗結果表明不同劑量組能部分下調PI3K、pAKT、mTOR基因表達，且中劑量組下調程度較其它治療組明顯，高、低劑量組及聯合組下調pAKT程度相當，值得注意的是紅豆杉聯合赫賽汀后較紅豆杉單藥組下調各靶點的表達并未顯著增強，這些差異提示雖然部分抑制了此信號通路的激活，HER2陽性胃癌仍可以通過其他信號通路起到抑制腫瘤細胞增殖作用。當然我們也不能排除實驗本身因素，NCI-N87細胞出現的耐藥性，我們沒有進一步檢測，這也是課題組進一步研究的方向，靶向藥物固然效果優勢明顯，但不可否認臨床上大部分接受曲妥珠單抗治療有效的患者往往1年內產生耐藥[5]。

綜上所述，南方紅豆杉水提物可以促進胃癌細胞的凋亡，其中劑量組誘導作用較強，與西藥組相當;南方紅豆杉水提物可以通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制該信號通路相關靶點，導致細胞凋亡;另外，通過實驗也發現存在除PI3K/AKT/mTOR信號通路外其他旁路或下游通路等從而抑制HER2陽性胃癌發展的機制。

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