鼓膜組織工程學研究進展

黎歡 胡益 姚旭 吳淋蓉 沈毅

[摘要] 鼓膜穿孔是耳鼻喉科常見的臨床癥狀，慢性鼓膜穿孔治療主要通過手術修補，各種自體移植材料常被作為移植物來修補穿孔鼓膜。近年來，鼓膜再生領域的研究逐漸趨向于應用組織工程學治療技術。許多新型組織工程材料在鼓膜修復中體現出良好的鼓膜再生和聽力重建效果。然而，組織工程鼓膜的制作需要考慮多種因素。本綜述通過總結概括目前在鼓膜穿孔修復中所使用的支架材料、生物活性分子和細胞來闡述鼓膜再生的組織工程學研究進展。

[關鍵詞] 鼓膜穿孔;組織工程學;支架;生物活性分子

[中圖分類號] R764 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）08-0164-05

[Abstract] Tympanic membrane（TM） perforation is a common clinical symptom in the department of otolaryngology. Presently， chronic TM perforation is mainly treated by surgery， with various graft materials （e.g. autologous cartilage and fascia） being used as patches to repair TM perforations. Resent research in the field of TM regeneration tends to the tissue engineering techniques. These tissue-engineered materials have showed good results in perforation closure and acoustic function reconstruction. However， various factors need to be considered in the manufacture of bio-engineered TM. This review describes the advances in research of TM tissue engineering by summarizing the scaffold materials， bioactive molecules （BMs） and cells currently used for TM wound healing.

[Key words] Tympanic membrane perforation; Tissue engineering; Scaffold; Bioactive molecule

鼓膜穿孔是耳科常見癥狀，多由慢性化膿性中耳炎或耳外傷所致。慢性鼓膜穿孔會導致聽力下降、反復中耳感染和膽脂瘤[1]。慢性化膿性中耳炎引起的鼓膜穿孔甚至會導致嚴重的顱內外并發癥[2]。目前治療慢性穿孔的方法通常是實施鼓膜修補手術，運用各種自體組織（包括顳肌筋膜、軟骨、脂肪、軟骨膜）來修補穿孔鼓膜。盡管這些材料有一定效果，但都有其局限性。自體移植會損傷自身組織，并且在二次手術時取材受限。另一方面，同種異體移植物和異種移植物具有潛在的感染風險[3]。更重要的是，這些移植物均不能復制出原始鼓膜復雜的精細結構和聲學振動特性[4]。近年來，隨著現代醫學材料學和組織工程學的發展，我們看到了從簡單鼓膜移植物到組織工程人工鼓膜的演變。組織工程鼓膜的出現在鼓膜的修復治療中具有變革意義。

1 鼓膜組織工程學概念

組織工程學是通過體內或體外的方式實現：體內途徑是在組織培養或者生物反應器中重建器官，包括細胞和支架材料，而體外方法則是用非細胞支架的生物材料，擁有有助于細胞募集和分化的生物特性[5]。組織工程中三大重要的元素是支架材料、生物活性分子和細胞。支架材料為細胞增殖、遷移提供機械支撐，生物活性分子（bioactive molecules，BMs）則為細胞分化提供適宜的生化微環境。重要的是，這個工程的創建應該相互作用，在組織生長的開始和維持中要有動態交互性[6]。運用組織工程學概念進行鼓膜再生，可以為鼓膜穿孔提供更優的治療方法。

2 支架材料

2.1 脫細胞組織

脫細胞組織支架（同種異基因或異種）去除了細胞成分而保留大部分原來細胞外基質的生物活性和機械特性。這些支架最主要的優點是在微結構、成分和生物化學特性上與原組織的細胞外基質非常接近，然而，不同的供體組織也會有不同的變化。例如，脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix，ADM）是由人類同種異基因供體組織加工而成的，是一種冷凍干燥的脫細胞的真皮內基質和防腐的基底膜組成[7]。當ADM用于治療鼓膜穿孔時，它在組織學上常顯示炎癥反應帶，伴隨大量成纖維細胞浸潤、上皮增生和新生血管形成[8，9]。近期的動物實驗證明，在豚鼠模型中使用同種異體皮膚脫細胞支架材料修復鼓膜穿孔是安全有效的[10]。并且臨床試驗中發現，該材料能較易融入新生組織中且不會引起明顯的免疫反應，鼓膜修復效果理想[11]。其他脫細胞支架材料包括豬小腸黏膜脫細胞基質（SurgisisR）、豬膀胱脫細胞基質（urinary bladder matrix，UBM）、豬軟骨脫細胞基質（decellularized extracellular cartilage matrices，DECM）等[12-14]。SurgisisR是一種脫細胞豬小腸黏膜下基質，由膠原蛋白、纖連蛋白和糖胺聚糖組成，已被證實可促進鼓膜再生，但會導致明顯的炎癥反應和材料殘余[12]。UBM由膀胱基質脫細胞后的黏膜層和固有層組成，可提供一個完整的可供上皮移行的基膜支架。UBM補片較易與鼓膜組織相融且吸收完全，最終使再生的鼓膜具有正常的三層超微結構[13]。DECM支架在最新的體外研究中證實，在體外常壓和負壓下，其聲學振動特性在一定程度上與人鼓膜非常接近，可提供振動特性和高效聲透射的重要聲學要求，故DECM為鼓膜聲學傳導功能的重建提供了一個選擇，但其在人體內的聲學傳導特性還需進一步的體內實驗研究[14]。

2.2 多聚物

多聚物是比較理想的支架材料，因其具有有效性、生物相容性、生物可降解性、易操控性和規?；a潛能等優點[15]。自然多聚物目前正在作為鼓膜穿孔修復的潛在自然支架被研究和應用，包括明膠海綿、絲素蛋白、殼聚糖、藻酸鹽和透明質酸等[3]。（1）明膠海綿：來源于變性的豬皮膚，被廣泛地用作中耳填塞材料以支撐移植的鼓膜和聽骨[16]。明膠海綿也被用于修補鼓膜穿孔[17]，其無毒，具有良好的生物相容性，易于操作，且能夠促進止血;（2）絲素蛋白：通常來源于蠶絲，去除蠶絲外層抗原蛋白后，絲素蛋白被發現可促進多種細胞增殖和遷移，其中包括人鼓膜角質上皮細胞[18，19]，并可為鼓膜再生提供結構支撐;（3）殼聚糖：是甲殼素氮乙酰衍生物，見于自然界中形成甲殼類和昆蟲類支撐結構的黏多糖[20]。殼聚糖有抗菌特性，且被證實具有可改善皮膚、骨和肝臟創傷愈合的作用，三維殼聚糖支架材料被證實可在內植法鼓膜成形術中與再生鼓膜融合[21];（4）藻酸鹽：是一種來源于海藻的自然有機多聚物，當與鈣交聯后可提升該材料的可操作性。藻酸鈣移植物作為支架可供黏膜上皮細胞和角質上皮細胞生長。但它在理論上有耳毒性風險，目前尚缺乏其安全性和有效性的短期或長期研究[22];（5）透明質酸：是一種存在于黏多糖中的自然物質，已被證實可促進鼓膜穿孔愈合，并能減少新生鼓膜的瘢痕形成[23]。因此常被用做鼓膜修復的支架材料，尤其是經化學修飾（如交聯或酯化）的新型透明質酸材料。

2.3 合成材料

在合成材料中，已有聚甘油癸二酸酯（poly glycerol sebacate，PGS）、左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）被研究。PGS是一種可生物降解的合成多聚物，由聚甘油和癸二酸組成。PGS在栗鼠慢性鼓膜穿孔模型中顯示其能促進細胞再生和新生血管形成[24]。該材料的優點包括可調控的生物降解性、易于合成、良好的生物相容性等。此外，最新研究表明，PLLA和PLGA具有良好的生物相容性和安全性，并且在大鼠鼓膜穿孔動物模型中可促進鼓膜愈合，愈合的鼓膜具有正常的三層顯微結構[25，26]。

3 生物活性分子

鼓膜穿孔愈合是一個復雜的動態過程，是由細胞、細胞外基質和生物活性分子（如生長因子）之間相互作用和介導的過程。在慢性鼓膜穿孔的研究中，不同的生物活性分子均扮演著促進或延遲鼓膜愈合的角色。自從生長因子和其受體在鼓膜穿孔愈合中的作用被證實后，各類生長因子開始應用于動物實驗和臨床治療中。

生長因子可廣義上分為5種主要的家族：表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）。在鼓膜創傷愈合研究領域，EGF和FGF已被大量報道，而PDGF和TGF-β的研究比較有限，對于IGF目前僅有個別研究報道。

3.1 EGF家族

表皮生長因子家族由表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）、肝素結合生長因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）、雙向調節因子、細胞素和神經調節蛋白組成。EGF主要作用是促進細胞增殖，尤其是在鼓膜鱗狀上皮細胞層[27]，它可在早期導致大量成纖維細胞和新生血管形成，伴隨致密的結締組織層形成[28]。重要的是，EGF在中耳內無耳蝸與前庭毒性[29]，因此在人體中是安全的。TGF-α與EGF在結構和功能上相似，但TGF-α已被證明在提高菌落分散中較EGF更有效[30]，而且是許多物質的最有效的促進因子。近期研究表明，在小鼠慢性鼓膜穿孔模型中，使用HB-EGF修復穿孔顯示出較好的鼓膜愈合狀態，并且聽力恢復接近正常[31]。

3.2 FGF家族

在鼓膜中被研究較多的是堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），bFGF主要引起鼓膜上皮層和纖維層的增生，但對黏膜層影響較小[32]。使用bFGF后的前3 d能刺激成纖維細胞增殖以供上皮的移行[33，34]，在3 d后通過舒張血管加速穿孔愈合[35]。臨床研究顯示，在鼓膜穿孔第3天后（即創傷愈合的增殖期）使用bFGF對鼓膜修復有顯著作用。該方法不僅可顯著縮短鼓膜穿孔愈合時間，還可減少臨床給藥持續時間和與bFGF相關的副作用的發生[36]。最近的臨床試驗表明，每天持續小劑量bFGF[2～3滴/（次·d）]滴耳液能維持鼓膜潮濕環境，可促進鼓膜穿孔愈合，避免繼發膿性耳漏，縮短愈合時間;相反，大劑量bFGF引起的鼓膜水樣環境反而可能繼發膿性耳漏，從而延長愈合時間[37]。近期臨床試驗表明，聯用bFGF、明膠海綿和fibrin膠水治療一組慢性鼓膜穿孔患者，其具有較高的成功率，且操作簡單，不需要全身麻醉[38];然而，其中的作用機制和遠期效果目前尚不清楚。在人類中，與炎癥反應過程對比，bFGF似乎更主要作用于調節細胞增殖和遷移過程[39]。

3.3 PDGF家族

PDGF和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）組成一個高度受保護的PDGF/VEGF族。迄今為止，人們對鼓膜中的PDGF研究有限。在一項臨床試驗中，用含PDGF的紙質支架材料行局部治療6周，與對照組比較并沒有顯示出任何優點[40]。VEGF能夠增強血管通透性，促進新生血管的形成及血管內皮細胞的生長，是目前促進血管生成專屬性最高、活性最強的因子[41]。對鼓膜中VEGF的研究表明VEGF是一種重要的促進鼓膜血管再生的調節劑[42]。

3.4 TGF-β家族

TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，骨形態形成蛋白因子和激動素。TGF-β由創傷后活化的血小板釋放，其對細胞增殖、分化及細胞外基質合成具有重要調節作用，在創傷愈合中具有多種生物學活性[43]。然而，TGF-β引起細胞外基質在組織創面處沉積，從而導致過度的瘢痕增生以及纖維化[44]。

4 細胞來源

用于組織工程鼓膜的細胞可從機體組織、細胞系或干細胞中獲得。這些細胞在植入之前可以在體外被注入或者被混合成一定結構[45]。當前，細胞和生物支架聯合應用于鼓膜穿孔治療的相關研究還比較有限。

自體同源成纖維細胞種植于豬脫細胞ADM或豚鼠脫細胞硬腦膜后，組織再生加速并且新的細胞外基質在細胞種植組織中產生[46]。干細胞的作用也被擴展到鼓膜穿孔愈合中，經骨髓間充質干細胞治療的鼓膜在第1周后炎癥反應減弱，治療2周后恢復鼓膜三層結構[47]。然而，當用于大鼠動物模型時，卻沒有促進鼓膜愈合。最新研究揭示人類鼓膜祖細胞位于鼓膜臍部、鼓環和錘骨柄處，表明這些部位可能是鼓膜創傷愈合過程中干細胞再生活躍的部位[48]。

5 小結和展望

盡管既往在證明鼓膜創傷愈合的影響因素上做了許多努力，但是，慢性鼓膜穿孔的發病機制目前尚未明確，選擇何種生物活性分子和支架材料會產生最佳的鼓膜修復效果也亟待闡明。此外，缺乏一種可信的慢性鼓膜穿孔動物模型也是鼓膜創傷愈合研究領域的一個難點。無論細胞使用與否，支架材料和生物活性分子均是組織工程技術治療鼓膜穿孔的重要因素，兩者通過不同的機制來促使鼓膜創傷愈合，支架材料提供了基質支撐以引導鼓膜再生組織，而生物活性分子則促進鼓膜細胞增殖和遷移。雖然鼓膜組織工程學已取得了較大進步，但目前仍存在諸多挑戰，我們期望該領域研究不斷取得新的進步，并且鼓膜組織工程新技術能夠在臨床中得到應用。

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