藍(lán)莓汁花色苷指紋圖譜鑒偽可行性分析

潘少香，閆新煥，譚夢(mèng)男，劉雪梅，孟曉萌，鄭曉冬，李志成，曹寧

（中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南 250014）

藍(lán)莓（Blueberry）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.），多年生落葉或常綠灌木小漿果，原產(chǎn)于北美[1-3]。藍(lán)莓是越橘屬植物中營(yíng)養(yǎng)成分最豐富的種類，除含常規(guī)的有機(jī)酸、糖以外，還富含維生素A、E、B 以及多種微量元素，并且富含多種黃酮類、花色苷、多酚類化合物等成分，具有抗氧化活性、抗癌、降低膽固醇、延緩衰老等多種藥理活性[4,5]。以藍(lán)莓為代表的漿果類水果有“黃金水果”的美譽(yù)，但由于產(chǎn)量低、保鮮難度和成本較高，主要以加工為主，鮮食不足50%[6]。目前，藍(lán)莓多被加工成果汁、濃縮果汁、果醬等。國(guó)內(nèi)果汁行業(yè)正以平均每年20%的增長(zhǎng)率增長(zhǎng)，成為食品方面發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)[7]，漿果汁及其復(fù)合飲料市場(chǎng)份額不斷增長(zhǎng)，形成了新的果汁消費(fèi)市場(chǎng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)各大果汁飲料廠開(kāi)始重視漿果果汁的生產(chǎn)，但由于產(chǎn)量低、成本高，漿果果汁摻假、造假、錯(cuò)誤標(biāo)簽等導(dǎo)致的食品質(zhì)量和安全爭(zhēng)議不斷發(fā)生，果汁真?zhèn)舞b別技術(shù)面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，常用的漿果真?zhèn)螜z測(cè)方法，一是基因技術(shù)，利用PCR 技術(shù)對(duì)果汁中未知物進(jìn)行鑒偽篩查[8-10]；二是同位素分析法，利用質(zhì)譜或核磁技術(shù)對(duì)果汁中C、H、O 等同位素特征比例精確測(cè)定外源添加物含量[11-13]。這些方法在漿果果汁鑒定上有一定的準(zhǔn)確性，但過(guò)程相對(duì)繁瑣，不易實(shí)現(xiàn)，尤其是測(cè)定多品種混合的果汁，方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和檢測(cè)范圍將會(huì)受到很大限制。市售漿果果汁飲品售價(jià)高昂且質(zhì)量參差不齊，消費(fèi)者又很難通過(guò)簡(jiǎn)單的感官判斷加以鑒別，而現(xiàn)行分析檢測(cè)技術(shù)方法無(wú)法完全滿足上述要求。因此，亟需一種快捷、可靠的漿果果汁摻偽識(shí)別技術(shù)。

近年來(lái)，特征性化學(xué)成分的識(shí)別是漿果及其果汁檢測(cè)中興起的一個(gè)熱點(diǎn)。通過(guò)特征成分檢測(cè)或建立特征成分指紋圖譜來(lái)進(jìn)行果汁鑒偽的研究較多，但由于果汁中化合物天然含量較低和廣泛的物種變異性，效果不理想。藍(lán)莓中花色苷種類多，含量高[14,15]，在特征成分指紋圖譜鑒偽方面有很大的優(yōu)勢(shì)，本研究針對(duì)市售藍(lán)莓汁中經(jīng)常使用樹(shù)莓汁、石榴汁、葡萄汁等進(jìn)行以次充好現(xiàn)象，利用液相色譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法，建立了藍(lán)莓汁中花色苷的快速高效指紋圖譜鑒偽技術(shù)，為藍(lán)莓果汁的質(zhì)量控制提供一種有效的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮的藍(lán)莓、石榴、樹(shù)莓樣品，均購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南歷下大潤(rùn)發(fā)超市。

乙腈為色譜純，Thermo fisher USA；甲酸為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，18.2 MΩ。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000 反相高效液相色譜儀（Thermo fisher，USA），包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和DAD 檢測(cè)器；明澈D24 UV超純水儀，美國(guó)Millipore；破壁料理機(jī)，九陽(yáng)JYL-Y15；KQ-500E 超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 供試品制備

為保證果汁的真實(shí)性，試驗(yàn)所用藍(lán)莓汁、石榴汁和樹(shù)莓汁均由實(shí)驗(yàn)室自制，將藍(lán)莓、樹(shù)莓分別放入破壁料理機(jī)中打漿，漿體直接壓榨取汁。石榴汁由石榴籽粒直接壓榨取汁制得。將純果汁和水1：2 稀釋混勻后，以5000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，過(guò)0.45 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓汁花色苷檢測(cè)方法優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

液相流動(dòng)相選擇甲酸/水和乙腈，經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后液相色譜條件如下：選用AcclaimTM120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相A，10%甲酸/水；流動(dòng)相B，水：甲酸：乙腈=4：1：5；紫外線檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm；流速為1 mL/min；柱溫40 ℃。液相色譜洗脫條件采用梯度洗脫（見(jiàn)下頁(yè)表1），優(yōu)化后藍(lán)莓汁花色苷色譜圖如圖1（見(jiàn)下頁(yè)）所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

圖1 藍(lán)莓汁花色苷色譜圖Fig.1 Anthocyanin chromatogram of blueberry juice

從圖1 中可以看出，藍(lán)莓汁花色苷存在7 個(gè)色譜峰，分 別 出 現(xiàn) 在 9.370、16.383、18.653、19.237、20.558、21.310、23.693 min 處。7 種花色苷能夠明顯分開(kāi)，該方法的分離度較好。

2.1.2 花色苷檢測(cè)方法學(xué)考察

（1）精密度

同一藍(lán)莓汁樣品，連續(xù)檢測(cè)6 次，記錄上述7 種花色苷色譜圖峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD，由于精密度和穩(wěn)定性的檢測(cè)方法相同，且精密度對(duì)進(jìn)樣時(shí)間沒(méi)有要求，因此精密度和穩(wěn)定性使用同一組數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2，花色苷的RSD 均小于1.5%，精密度良好。

（2）穩(wěn)定性

取藍(lán)莓汁供試樣，按上述色譜方法，每隔2 h 進(jìn)一針，連續(xù)檢測(cè)6 次，記錄上述7 種花色苷色譜圖峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2 中可以看出，7 種花色苷的RSD 均小于1.5%，說(shuō)明花色苷供試溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性

按1.3 項(xiàng)中的方法制備6 個(gè)藍(lán)莓樣品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可以看 出， 樣 品 中 9.370、16.383、18.653、19.237、20.558、21.310、23.693 min 處的色譜峰面積RSD 分別為2.8%、2.8%、3.2%、5.7%、1.5%、4.7%、2.9%。7 個(gè)色譜峰的峰面積RSD 均在6%以內(nèi)，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 常見(jiàn)摻假果汁指紋圖譜色譜峰比對(duì)

將藍(lán)莓汁中常見(jiàn)的摻假果汁石榴汁和樹(shù)莓汁按照上述樣品處理和檢測(cè)方法操作，比較三種樣品花色苷色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2 中可以看出，石榴汁中花色苷數(shù)量只有4 種，分別出現(xiàn)在5.93、8.657、11.923、12.757 min 處，樹(shù)莓汁中峰形較明顯的花色苷有5 種，分別出現(xiàn)在11.223、12.867、18.243、19.700、23.283 min 處。比較藍(lán)莓汁、石榴汁、樹(shù)莓汁三種果汁花色苷色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，每種果汁花色苷色譜圖出峰時(shí)間及峰面積各不相同，均具有特異性。

表2 方法精密度和穩(wěn)定性Table 2 Method precision and stability

表3 方法重復(fù)性Table 3 Method repeatability

圖2 藍(lán)莓汁、石榴汁和樹(shù)莓汁的花色苷液相色譜圖Fig.2 Anthocyanin liquid chromatogram of blueberry juice,pomegranate juiceand raspberry juice

2.3基于化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

2.3.1 花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)化

利用上述方法檢測(cè)藍(lán)莓、石榴、樹(shù)莓供試液中的花色苷，每個(gè)樣品重復(fù)一次，記錄花色苷的出峰時(shí)間和峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4（見(jiàn)下頁(yè)）。將花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)化，便于進(jìn)一步結(jié)合計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析，能夠更加直觀地反映出不同樣品花色苷的差異。

從表4 中可以看出，藍(lán)莓、石榴、樹(shù)莓三種樣品的花色苷品種和含量各不相同。從藍(lán)莓、石榴、樹(shù)莓三種樣品中共檢測(cè)出16 種花色苷，為了更加直觀地反應(yīng)三種樣品的差異，采用降維分析法中的主成分分析法以及聚類分析法對(duì)三種樣品做進(jìn)一步的分析。

2.3.2 花色苷指紋數(shù)據(jù)主成分分析

采用SPSS 25.0 對(duì)不同樣品不同保留時(shí)間的花色苷峰面積做主成分分析，選取兩個(gè)主成分，主成分的特征向量和載荷見(jiàn)表5（見(jiàn)下頁(yè)）。

從表5 中可以看出，第一主成分中貢獻(xiàn)率比較大的成分是保留時(shí)間為9.76、16.383、18.653、19.237、23.693 min 處的色譜峰，這5 種色譜峰在藍(lán)莓汁中出現(xiàn)，未在石榴汁和樹(shù)莓汁中出現(xiàn)，是藍(lán)莓汁的特征花色苷峰，這說(shuō)明第一主成分主要反映的是藍(lán)莓汁花色苷的變異信息。石榴汁和樹(shù)莓汁花色苷色譜峰在第二主成分有較高的響應(yīng)，說(shuō)明這一主成分主要反映的是石榴汁和樹(shù)莓汁花色苷的變異信息。以第一主成分值為橫坐標(biāo)，第二主成分值為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖（見(jiàn)第11 頁(yè)圖3）。第一、第二主成分綜合貢獻(xiàn)率達(dá)到95%，說(shuō)明前兩個(gè)主成分基本上可以解釋大部分花色苷含量的變異信息。從主成分分析圖中可以看出，不同樣品在主成分分析圖中能夠明顯的分開(kāi)，且根據(jù)品種劃分為三個(gè)區(qū)域分布在不同的象限中，說(shuō)明三個(gè)品種的果汁中花色苷種類和含量存在顯著的差異。

表4 藍(lán)莓汁、石榴汁、樹(shù)莓汁花色苷保留時(shí)間及峰面積Table 4 Retention time and peak area of anthocyanin in blueberry juice, pomegranate juice and raspberry juice

表5 2 個(gè)主成分的特征向量和載荷Table 5 Principal component eigenvectors and loading matrix

圖3 三種果汁主成分散點(diǎn)圖Fig.3 PCA biplot of three juice

2.3.3 花色苷指紋圖譜數(shù)據(jù)聚類分析

采用SPSS 25.0 對(duì)不同樣品不同保留時(shí)間的花色苷峰面積做聚類分析，聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖4。從聚類樹(shù)狀圖中可以看出，藍(lán)莓、石榴、樹(shù)莓樣品能夠明顯的分為三類，每個(gè)品種自動(dòng)聚為一類，說(shuō)明三種樣品的花色苷指標(biāo)存在明顯的差距。同時(shí)從聚類分析圖中可以看出藍(lán)莓汁色譜圖與石榴汁和樹(shù)莓汁的間距都比較大，這說(shuō)明藍(lán)莓汁花色苷指紋圖譜的特異性較大。

圖4 三種果汁聚類分析樹(shù)狀圖Fig.4 The cluster analysis diagram of three kinds of fruit juice

3 討論

3.1 藍(lán)莓汁花色苷提取方法的選擇

為提高花色苷的提取率，一般采用有機(jī)試劑乙醇、甲醇等對(duì)樣品進(jìn)行提取[14,16]，本實(shí)驗(yàn)研究目的在于鑒偽，無(wú)需考慮樣品中花色苷具體含量的高低，因此選擇將樣品直接稀釋過(guò)濾上機(jī)，這樣可以避免樣品在提取過(guò)程中造成的差異，同時(shí)避免提取物質(zhì)雜峰對(duì)鑒偽花色苷成分的干擾。

3.2 藍(lán)莓花色苷指紋圖譜檢測(cè)方法的建立

本試驗(yàn)建立的藍(lán)莓花色苷指紋圖譜檢測(cè)方法穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度良好，能夠檢測(cè)出藍(lán)莓汁中特征花色苷成分，并且分離度良好，同時(shí)對(duì)石榴汁和樹(shù)莓汁樣品進(jìn)行了檢測(cè)，也能夠檢出并分離開(kāi)石榴汁和樹(shù)莓汁樣品中的花色苷成分，這充分說(shuō)明了藍(lán)莓花色苷指紋圖譜檢測(cè)方法的有效性。

3.3 不同果汁指紋圖譜色譜峰比對(duì)

對(duì)藍(lán)莓汁、石榴汁和樹(shù)莓汁三種果汁的花色苷指紋譜圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)，并利用分析軟件進(jìn)行了主成分分析和聚類分析，聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果相符，結(jié)果表明三種果汁的花色苷指紋圖譜具有較大的差異性，能夠得到明顯的區(qū)分，這說(shuō)明不同樣品花色苷真實(shí)性評(píng)價(jià)是可行的，花色苷指紋圖譜可以作為藍(lán)莓汁真?zhèn)舞b別的依據(jù)。