輕度認(rèn)知功能障礙患者的腸道菌群特征☆

曾秀麗 譚楚紅 吳齊恒 何彥 尹恝 朱佳佳

輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment,MCI）是介于正常衰老與輕度癡呆的一種病理狀態(tài)[1]。中國(guó)老年人群中MCI患病率高達(dá)20.8%[2]，且以每年增加15.0%的速度轉(zhuǎn)化為癡呆。MCI患者轉(zhuǎn)化成癡呆的風(fēng)險(xiǎn)比普通老年人高了近10倍[3]。研究表明，腸道菌群可能在認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[4-5]。然而目前的研究多基于PAP轉(zhuǎn)基因癡呆型小鼠，且研究結(jié)果不一致[6-8]。基于人群的研究有限，且報(bào)告均來(lái)自其他國(guó)家[9-10]。因此本研究擬在社區(qū)招募健康的中老年人，通過(guò)對(duì)受試者進(jìn)行認(rèn)知功能、腸道菌群及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，進(jìn)而初步探究輕度認(rèn)知功能障礙患者的危險(xiǎn)因素和菌群特征。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象受試者來(lái)源于2016年12月至2017年1月在廣東省廣州市農(nóng)墾總局老干所和燕嶺醫(yī)院社區(qū)開(kāi)展的卒中風(fēng)險(xiǎn)篩查項(xiàng)目。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡50歲以上；②日常生活完全自理；③客觀認(rèn)知功能受損[11]：蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估基礎(chǔ)量表（Montreal cognitive assessment-basic，MoCA-B）的分界值為：學(xué)歷低于6年，≤19分；學(xué)歷7～12年，≤22分；學(xué)歷超過(guò)12年，≤24分；④臨床癡呆評(píng)定量表（clinical dementia rating,CDR）＜0.5 分；⑤廣州居住時(shí)間超過(guò)3年，每年超過(guò)10個(gè)月，近期無(wú)跨境旅游。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為癡呆（阿爾茨海默病（Alzheimer disease,AD）、血管性癡呆等）；②有影響認(rèn)知功能評(píng)估的疾病或無(wú)法配合（視力、聽(tīng)力障礙；焦慮、抑郁狀態(tài)或治療狀態(tài)）；③既往心腦血管疾病史（腦出血、腦卒中、急性心肌梗死等）；④3個(gè)月內(nèi)口服抗生素、益生菌和（或）益生元。本研究遵循赫爾辛基宣言，獲得了南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn) （倫理批準(zhǔn)號(hào)：NFEC-2016-148），征得了受試者本人的同意并簽署知情同意書(shū)。本研究共納入了93例受試者，并分成兩組：輕度認(rèn)知功能障礙組 （mild cognitive impairment,MCI）和對(duì)照組（normal cognitive,NC），采集受試者的空腹抗凝血和新鮮糞便樣本。

1.2 糞便總DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序新鮮糞便樣本在采集后4 h內(nèi)凍存在-80℃冰箱。200 mg糞便樣本使用磁珠法進(jìn)行糞便細(xì)菌總DNA的提取（糞便樣本總DNA磁珠法提取試劑盒，深圳易瑞生物技術(shù)有限公司）。通過(guò)羅氏480定量qPCR儀擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V4可變區(qū)。將PCR產(chǎn)物等濃度混勻后純化，送廣州美格生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)采集研究采用問(wèn)卷調(diào)查的形式記錄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。10年缺血性心血管病評(píng)分（ischemic cardiovascular disease,ICVD）[12]用于綜合評(píng)價(jià)長(zhǎng)期心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。MoCA BC是一種可靠的認(rèn)知篩查測(cè)試，在國(guó)內(nèi)老年人群中具有較高的可接受性和較好的信度[11]，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估。兩名有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生通過(guò)二維B型超聲儀器（美國(guó)通用電氣公司）獲取頸動(dòng)脈超聲數(shù)據(jù)：雙側(cè)頸總動(dòng)脈的內(nèi)膜中層厚度和斑塊的性質(zhì)（回聲、數(shù)量、大小）。將所測(cè)得的所有獨(dú)立斑塊厚度相加后得到的數(shù)值即為Crouse積分，可簡(jiǎn)單量化頸動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。常規(guī)的生化指標(biāo)（如肝腎功能等）送南方醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)。通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)糞便中短鏈脂肪酸 （short-chain fatty acid,SCFA） 濃度。血漿內(nèi)毒素（lipopolysaccharide,LPS）、內(nèi)毒素結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein,LBP）、D-乳酸 （D-Lactic Acid,D-LA）和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白 （intestinal fatty acid binding protein,iFABP）濃度由酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定，檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州昂飛生物科技有限公司。血漿炎癥因子由液相芯片法測(cè)定，檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.4 生物信息獲取與統(tǒng)計(jì)研究人員在QIIME平臺(tái)對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控和去嵌合，以供后續(xù)的菌群分析與統(tǒng)計(jì)。菌群的多樣性指標(biāo)分為α多樣性和β多樣性。前者是指樣本內(nèi)的物種多樣性，常用指標(biāo)有：系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（phylogenetic diversity whole tree，PD whole tree） 和 Shannon 指數(shù)。后者反映樣本間的物種多樣性差異。Bray-Curtis距離是基于可分類的操作單元（operational taxonomic units,OTUs）的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，本研究采用Bray-Curtis距離矩陣來(lái)展示不同樣本之間的β多樣性差異。而主坐標(biāo)分析 （principal coordinates analysis,PCoA）可使距離矩陣降緯成可視化的三維立體圖形。樣本間的距離表示樣本間的差異來(lái)源，組間多樣性差異的顯著性由Adonis檢驗(yàn)來(lái)確定，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

本研究采用線性判別效應(yīng)分析 （linear discriminant analysis effect size,LefSe）[13]來(lái)展示兩組之間的差異菌群。LEfSe分析是基于Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來(lái)挑選組間的差異菌屬，并計(jì)算不同菌屬的效應(yīng)值大小，效應(yīng)值≥2.0的細(xì)菌通常被認(rèn)為差異顯著。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，非正態(tài)分布連續(xù)變量采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；分類變量比較采用χ2檢驗(yàn)。采用單因素logistic回歸分析，挑選出P＜0.05的變量為差異變量。將年齡、性別、教育水平作為混雜因素對(duì)有統(tǒng)計(jì)差異的變量進(jìn)行校正。采用forward和backward的方法將上述變量納入多因素logistic回歸模型，得到最具有差異的因子。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況與菌群代謝、腸道屏障、炎癥因子檢測(cè)93例受試者中，MCI組28例，平均年齡66.3歲，男13例。NC組65例，平均年齡61.7歲，男26例。兩組人群的一般情況 （年齡、性別和教育水平）、生活方式（如吸煙、飲酒、飲食習(xí)慣、是否缺乏體育鍛煉、排便是否順暢）、既往病史（如高血壓、糖尿病）等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。血漿內(nèi)促炎因子（如 TNFα、IFN γ、IL-1β、IL-6、IL-22 等）、抗炎因子IL-4及反映內(nèi)皮細(xì)胞功能 （如MMP9、VEGF-A、CD138、ICAM-1、E-Selectin 等）等指標(biāo)，兩組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。此外，MCI組的糞便內(nèi)SCFA，如乙酸、丙酸、丁酸等濃度較低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。 血漿 LPS、LBP、D-LA、iFABP是反映腸道屏障的常用指標(biāo)，兩組比較也未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 MCI患者的腸道菌群特征與NC組相比，MCI組的菌群α多樣性稍高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖 1A-B）。 基于 Bray-Curtis距離的 β多樣性分析顯示，MCI組和NC組之間的腸道菌群構(gòu)成存在顯著差異（P=0.03,Adonis test,圖1C）。門(mén)水平（圖1E）和科水平（圖1F）的菌群構(gòu)成圖表示的是兩組之間的菌群平均豐度變化。進(jìn)一步的LEfSe分析顯示，MCI組的腸道內(nèi)變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)豐度增加，主要表現(xiàn)為變形菌門(mén)下的腸桿菌科、氨基酸球菌科，厚壁菌門(mén)下的乳酸桿菌科，互養(yǎng)菌門(mén)的互養(yǎng)菌屬等細(xì)菌的富集 （圖1D）。

2.3 MCI危險(xiǎn)因素分析單因素logistic回歸分析（表 1） 提示， 年齡 （OR=1.056，P=0.029）、 肌酐（OR=1.036，P=0.016）、動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)（如內(nèi)膜中層平均厚度、Crouse積分和不同性質(zhì)的斑塊數(shù)量等）均與認(rèn)知功能障礙相關(guān)（P＜0.05）。此外，變形菌門(mén)及其下的變形菌綱、腸桿菌科、氨基酸球菌、乳酸桿菌科及其下的乳酸桿菌也是MCI的潛在危險(xiǎn)因子（P＜0.05）。校正年齡、性別、教育水平等混雜因素后，Crouse積分、高回聲斑塊數(shù)量、斑塊總數(shù)量等動(dòng)粥指標(biāo)及變形菌門(mén)、乳酸桿菌等細(xì)菌豐度仍與MCI相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。納入上述變量的多因素logistic回歸分析提示，高回聲斑塊數(shù)量（B=2.443,OR=11.511,95%CI：1.406～94.226,P=0.023）和乳酸桿菌高豐度（B=1.588,OR=4.894,95%CI：1.090～21.966,P=0.038）與 MCI關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究表明，和認(rèn)知功能正常患者相比，輕度認(rèn)知功能障礙患者的菌群特征主要表現(xiàn)為變形菌門(mén)及其下的腸桿菌科和乳酸桿菌科的富集。在健康成人的腸道中只占小部分[14]的變形菌門(mén)，其豐度一旦過(guò)度增長(zhǎng)會(huì)使內(nèi)部固有菌群抵抗外來(lái)病原菌定殖的能力下降，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)和病原體入侵。因此，變形菌門(mén)的富集也被認(rèn)為是一種腸道菌群紊亂的標(biāo)志，具有潛在的疾病診斷價(jià)值[15]。來(lái)自意大利的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MCI患者腸道內(nèi)的變形菌門(mén)下的細(xì)菌大腸桿菌或志賀氏桿菌的相對(duì)豐度增加[10]，這與本研究結(jié)果基本一致。兩個(gè)研究的主要區(qū)別是前者采用qPCR方法檢測(cè)患者腸道菌群中的幾種常見(jiàn)細(xì)菌的相對(duì)豐度，而后者則使用16S rRNA測(cè)序的方法評(píng)估了患者腸道內(nèi)菌群，腸屏障和代謝情況，研究的方法和側(cè)重點(diǎn)有所不同。但是兩個(gè)研究的結(jié)果都提示MCI患者腸道內(nèi)潛在致病的變形菌門(mén)的富集。

乳酸桿菌被認(rèn)為是傳統(tǒng)的有益菌，在特定細(xì)菌的作用下能將乳酸轉(zhuǎn)化成具有抗炎作用的丁酸等SCFA[16-17]。國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌干預(yù)可以改善AD患者的認(rèn)知[18]。然而，研究者對(duì)腸道內(nèi)乳酸桿菌的作用仍持有爭(zhēng)議。一系列臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌在心腦血管疾病相關(guān)的人群[19-21]的腸道或血液內(nèi)富集。在本研究中，MCI患者腸道內(nèi)乳酸桿菌豐度較高，而且這種顯著性經(jīng)多因素logistic回歸分析后依舊存在。腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸菌和丁酸鹽濃度的下降，往往伴隨著產(chǎn)乳酸菌的升高[22-23]，兩類細(xì)菌似乎存在著拮抗作用。研究發(fā)現(xiàn)，AD小鼠的糞便和腦組織SCFA濃度下降[24]，而丁酸鹽干預(yù)能改善小鼠的認(rèn)知[25]，這提示腸道代謝產(chǎn)物SCFA濃度降低與認(rèn)知受損有關(guān)。腸道內(nèi)乳酸桿菌升高導(dǎo)致的短鏈脂肪酸生成減少可能是導(dǎo)致輕度認(rèn)知功能障礙的潛在機(jī)制。本研究中的認(rèn)知輕度受損患者，雖然腸道菌群構(gòu)成已經(jīng)出現(xiàn)了早期的改變，糞便SCFA水平較低，但是菌群代謝、腸道屏障、外周炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞功能等指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。乳酸桿菌在MCI的發(fā)生發(fā)展中扮演的角色仍需要深入研究。

圖1 MCI組和NC組的菌群差異比較。A：菌群系統(tǒng)發(fā)育多樣性；B：Shannon指數(shù)；C：基于Bray-Curtis距離的β多樣性三維PCoA圖，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，坐標(biāo)軸下的數(shù)值代表對(duì)差異的解釋度；D：兩組LEfSe結(jié)果差異分類群及其效應(yīng)值大小(LDA≥ 2.0的分類群)；E：兩組菌群門(mén)水平構(gòu)成相對(duì)豐度餅圖；F：兩組菌群科水平的菌群構(gòu)成餅圖，不同的顏色代表不同的腸道細(xì)菌

表1 MCI危險(xiǎn)因素的單因素logistic回歸分析

在單因素邏輯回歸分析中，頸總動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度、Crouse積分、斑塊數(shù)量與認(rèn)知功能障礙有較強(qiáng)的相關(guān)性。研究表明，CCAIMT與無(wú)癥狀頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的認(rèn)知功能減退相關(guān)[26]，這與我們的研究結(jié)果基本一致。此外，CCAIMT可以預(yù)測(cè)認(rèn)知功能減退的進(jìn)展[27]，提高M(jìn)CI向癡呆轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[28]。斑塊數(shù)量是評(píng)估動(dòng)脈硬化最簡(jiǎn)單方便的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)不同性質(zhì)的斑塊數(shù)量是MCI的危險(xiǎn)因素。經(jīng)多元邏輯回歸分析，高回聲斑塊數(shù)量仍具有較顯著的相關(guān)性。因此，在面對(duì)合并多個(gè)穩(wěn)定斑塊的頸動(dòng)脈硬化患者，臨床醫(yī)生需考慮對(duì)患者進(jìn)行早期的認(rèn)知評(píng)估。

綜上所述，本研究表明，MCI患者的菌群特征為變形菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)和乳酸桿菌的富集。腸道內(nèi)乳酸桿菌高豐度及多發(fā)高回聲斑塊是MCI的可能危險(xiǎn)因素。鑒于本研究對(duì)象研究樣本量較少，且缺乏長(zhǎng)期的隨訪，輕度認(rèn)知功能障礙患者的菌群特征仍需大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。