人重鏈鐵蛋白偶聯HER2抗體的純化及其在成像中的初步應用

殷惠，陳龍，張文遠，朱新杰，許諾，王婷婷，盛復庚

1.安徽醫科大學 解放軍307臨床學院，北京 100071；2.解放軍總醫院 第五醫學中心南院區放射科，北京 100071；3.北京大學 化學與分子工程學院，北京 100871

近年來，隨著生物醫學技術的發展，越來越多的納米材料用于癌癥的靶向成像及治療，但普遍存在安全性及生物相溶性差的缺點[1]。鐵蛋白是人體內普遍存在的鐵代謝蛋白，生理狀態下形成24 聚體的籠狀結構，內外徑分別為8、12 nm，其內部空腔可以載藥[2-4]。鐵蛋白作為藥物載體具有生物相容性高及易于工程改造的優點[5]。目前，很多研究以鐵蛋白作為載體，包載治療或成像藥物，進行癌癥的診斷或治療[6]。其機理主要是借助重鏈鐵蛋白（heavy chain ferritin，HFn）與人轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）結合，發揮其功能[7]。但從靶向腫瘤遞送角度，需要增加鐵蛋白的靶向性，使其更好地定位于腫瘤細胞，因而提高其靶向性也是目前關注的熱點之一。通過不同靶向配體的化學修飾，或遺傳修飾的方法提高鐵蛋白的靶向性，已經取得了一些成功。相關報道如在鐵蛋白表面修飾RGD，通過RGD 與整合素αⅤβ3的結合，將鐵蛋白靶向癌細胞；或將鐵蛋白與細胞黏附分子偶聯，靶向內皮，從而提高對肺血管系統的靶向等[8-9]。單克隆抗體作為特異性的靶向分子，將鐵蛋白與臨床常用抗體偶聯，既可以提高鐵蛋白的靶向性，也有利于將鐵蛋白納米材料向臨床轉化。

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）是臨床上許多腫瘤如乳腺癌、胃癌等的重要治療靶點。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國的乳腺癌發病率逐年上升，并且患者中的15%～23%表現為HER2 陽性[10]。曲妥珠單抗（商品名為赫賽汀）作為一種人源化的單克隆抗體，可以特異地與表面高表達HER2的乳腺癌細胞結合，進而通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-depen?dent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）產生抗腫瘤活性，是臨床治療乳腺癌的主要方式之一[11-12]。雖然曲妥珠單抗的靶向治療改善了HER2 陽性乳腺癌患者的預后，但仍有相當一部分患者會復發并死亡。目前，除了繼續研究靶點不同的分子靶向藥物，針對關鍵基因、信號通路等的研究也在探索中。但臨床研究更傾向于將不同機制靶向藥物進行聯合治療，如將靶向藥物與化療藥物聯合使用，或將靶向藥物與內分泌聯合治療等[13]。盡管有關曲妥珠單抗治療的臨床數據豐富，但許多重要問題仍未得到解決，包括最佳治療持續時間，以及如何最好地將曲妥珠單抗與細胞毒性試劑和其他藥劑聯合使用以最大限度地提高療效，同時盡量減少毒性等。2016年有關MM-302的實驗已進入臨床試驗階段，主要是設計一種既有HER2 陽性細胞靶向性，又有抗腫瘤細胞毒性的靶向-化療藥物偶聯物，以曲妥珠單抗為靶向分子，以期達到減毒增效的目的[14]。

在本研究中，我們采用類似于抗體偶聯藥物（antibody drug conjugate，ADC）的設計思路，將臨床常用抗HER2 抗體（曲妥珠）與載體材料HFn 偶聯成靶向復合物HFn/anti-HER2，從而增加對HER2 陽性的乳腺癌（HER2+MDA-MB-231-Luci）的腫瘤靶向。結果表明靶向復合物HFn/anti-HER2 在體內外能更好地靶向HER2 陽性細胞，驗證了臨床常用抗體與HFn 偶聯的可能性，結合鐵蛋白藥物載體和抗體高靶向性的優勢，可以大大提升鐵蛋白在生物醫藥方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8 周齡 SPF 級 BLBC/c 雌性裸鼠（北京維通利華有限公司），實驗過程中對動物的處理符合動物倫理學標準（許可證編號為LA2018033）；標記螢光素酶基因的HER2 陽性及陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231-Luci（本實驗室保存）；重鏈鐵蛋白菌種由中國農業大學趙廣華教授提供；大腸桿菌BL21 感受態（天根生化有限公司）；質粒小提試劑盒、蛋白 marker、BCA 試劑盒、TEMED（Bio-Rad 公司）；DMEM 培養基（上海素爾生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（上海捷倍思基因技術有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液（100×）（碧云天生物技術）；Mal-PEG-NHS（ToYongBio 公司）；曲妥珠單抗（國藥準字J20110020）；D-熒光素鉀鹽（Thermo Fisher Scientific 公司）；其余所用試劑均為分析純。

AKTA start 蛋白純化儀、Superdex 200 凝膠過濾柱（GE Healthcare 公司）；純水儀（Milli-pore 公司）；小動物活體成像儀IVIS LuminaⅢ（珀金埃爾默公司）；分光光度計Nanodrop2000C（Thermo Sci?entific 公司）；馬爾文粒徑分析儀（Malvern Instru?ment 公司）；透射電子顯微鏡（日立公司）；激光共聚焦顯微鏡（卡爾蔡司公司）。

1.2 重鏈鐵蛋白誘導表達和鑒定

將 10 μL 菌液接種到 1 mL 含 100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養基中，37℃、220 r/min 振搖1 h，提取質粒，測序。蛋白表達純化過程參照Uchi?da 等的方法[15]，但加熱步驟改為在65℃而不是60℃下進行，并使用鎳柱純化。挑取轉化平板上的單克隆接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素的10 mL LB 培養液試管中，37℃、220 r/min 振搖 4～6 h；按 1∶100 接種于含 100 μg/mL 氨芐青霉素的 1 L LB 培養液中，37℃、220 r/min 振搖至菌液D600nm為 0.6～0.8（約 4～6 h）；加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，37℃、220 r/min 振搖過夜，誘導蛋白表達；離心收菌，用PBS 重懸沉淀；重懸液經超聲波破碎后，65℃加熱15 min，離心；將上清緩慢加入硫酸銨（濃度約50%），4℃攪拌2 h，4℃冰箱過夜，12 000 r/min 離心10 min，倒掉上清，沉淀復溶；65℃水浴加熱15 min，離心15 min 收集上清，過0.22 μm 濾膜后，用 30 kD 超濾管超濾 3 次，除硫酸銨，過鎳柱，收集蛋白；30 kD 超濾管超濾，除咪唑并濃縮至2 mL，過Superdex 200 凝膠過濾柱進行尺寸排阻層析；取層析后蛋白進行12% SDSPAGE，考馬斯亮藍染色顯帶。

1.3 細胞培養

用DMEM 培養基分別培養HER2 表達陽性及陰性的乳腺癌細胞HER2+MDA-MB-231-Luci 和HER2-MDA-MB-231-Luci，培養基中加入10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素。

1.4 靶向復合物HFn/anti-HER2的制備

異雙功能交聯劑馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯（Mal-PEG-NHS）用于人重鏈鐵蛋白與抗體的結合。偶聯過程如Elisabetta 所述[16]。室溫下取10 mg anti-HER2 與5 mg Mal-PEG-NHS，在 2 mL PBS 溶液（pH7.5）中反應 30 min，以30 kD 超濾管超濾除去未反應的Mal-PEG-NHS；再將其與人重鏈鐵蛋白在室溫下于PBS 緩沖液（pH7.0）里偶聯 1 h，30 kD 超濾管超濾 3 次，12 000 r/min 離心 10 min，過 0.22 μm 濾膜，4℃冰箱保存；用Superdex 200 凝膠色譜柱通過尺寸排阻凝膠色譜（SEC）純化復合后的納米載體；用 PBS 溶液（pH7.4），設置流速為 1 mL/min，純化樣品以除去游離抗體并收集分離純化后的HFn/anti-HER2。

1.5 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的表征

用馬爾文粒徑分析儀進行HFn 及復合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料的尺寸和Zeta 電位分析。樣品用0.22 μm 濾膜過濾，用去離子水稀釋至0.5 mg/mL。粒徑大小分布是通過數據分布進行統計的。

用透射電子顯微鏡分析HFn 及復合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料。用去離子水稀釋至0.5 mg/mL，滴一滴在碳支持膜上，3 min 后用濾紙吸干，再用磷鎢酸染色，2 min 后用濾紙吸干，并干燥，在80 kV的加速電壓下觀察。

1.6 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的熒光標記

用Cy5.5-NHS 標記目標蛋白。HFn 及復合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料標記相同量的熒光，蛋白與熒光以1∶2eq 比例標記，避光室溫振蕩反應過夜，通過G-25 Sephadex 脫鹽柱去除游離熒光團。本研究用BCA 試劑盒測量蛋白濃度，分光光度計測定熒光標記后的熒光強度。

1.7 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的體內外靶向

將HER2 陽性及陰性的乳腺癌細胞接種在共聚焦皿中，將熒光標記的納米材料加入相應的細胞中（Cy5.5 終濃度為200 nmol/L），在37℃培養箱中孵育20 min；用PBS 洗滌細胞3 次，加入DAPI染液（終濃度50 ng/mL）孵育15 min；再用PBS 洗滌細胞2 次，加入100 μL PBS；用激光共聚焦顯微鏡進行熒光顯像。

根據批準的方案進行動物實驗，建立HER2陽性乳腺癌荷瘤裸鼠模型，每只鼠肩背部接種5×105HER2 陽性 MDA-MB-231-Luci 細胞，1 周后進行生物發光成像。尾靜脈注射熒光標記的對照組 HFn-Cy5.5、實驗組 HFn/anti-HER2-Cy5.5 納米材料（Cy5.5 濃度為40 nmol/kg，120 μL），注射后0、2、8、24、48、96、144 h 分別用小動物活體成像儀進行熒光成像，并進行熒光信號統計。

1.8 統計分析

用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。計量資料采用x±s表示，2 組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人鐵蛋白重鏈的制備

鐵蛋白在大腸桿菌中表達，經鎳柱純化后進行SDS-PAGE，可見清晰的鐵蛋白亞基條帶（圖1），蛋白帶條帶單一，表明得到的HFn 純度高。

2.2 人重鏈鐵蛋白與抗HER2抗體的偶聯

用雙功能交聯劑Mal-PEG-NHS 將抗體和重鏈鐵蛋白偶聯（圖2），獲得的復合物通過尺寸排阻凝膠色譜表征，以確定交聯反應是否產生預期的可溶性大分子物質。結果見圖3，HER2 抗體吸收峰位置約在65 mL 處；偶聯后鐵蛋白吸收峰（55 mL 處）消失，在45 mL 處出現一個新的主峰即為HFn/anti-HER2，表明鐵蛋白與抗HER2 抗體偶聯成功。用HPLC 進行HER2 抗體的定量分析，計算HFn 綴合物的偶聯比例，HFn 與HER2 抗體起始摩爾比為1∶3.2，約59%的游離HER2 抗體在65 mL 處洗脫出來，對應于HFn，這表明每個HFn連接的HER2 抗體約為1.3 個。

2.3 靶向復合物HFn/anti-HER2的表征

通過透射電子顯微鏡和動態光散射表征HFn和靶向復合物HFn/anti-HER2。透射電子顯微鏡顯示HFn（圖4A）為特征性的納米殼-核結構，復合物HFn/anti-HER2（圖4B）仍表現為特征性的納米球形結構。動態光散射頻率曲線（圖4C）顯示復合后流體動力學直徑增加，單獨的HFn的平均直徑為7.11±0.12 nm，而復合物HFn/anti-HER2的平均直徑為16.88±0.49 nm（表1）。多分散指數（PDI）表明，和未與HER2 抗體偶聯的HFn 相比，復合物HFn/anti-HER2的單分散水平相似（分別為0.18±0.01 vs.0.16±0.03），兩者分散性很好，在水溶液中HFn 與靶向復合物HFn/anti-HER2的Zeta 電勢分別為-9.82±1.51、-6.59±0.86 mV。

2.4 復合物HFn/anti-HER2的體內外靶向驗證

圖1 重鏈鐵蛋白親和純化的SDS-PAGE分析

圖2 HER2抗體與HFn偶聯過程模式圖

為了在體外驗證靶向復合物HFn/anti-HER2的靶向性，首先進行了體外表征。腫瘤細胞在Cy5.5 通道信號（紅色）（波長設置為670 nm）結果顯示，靶向復合物HFn/anti-HER2 相對于HFn 本身在HER2 陽性乳腺癌細胞中的熒光強度更高（圖5，3～4）。同時，HER2 陽性乳腺癌細胞中較HER2 陰性細胞中熒光強度更高。表明靶向復合物 HFn/anti-HER2-Cy5.5 增加了 HFn 對 HER2 陽性乳腺癌的靶向性。

為了進一步驗證靶向復合物的靶向性，HFn與靶向復合物HFn/anti-HER2 標記熒光基團Cy5.5之后分別于尾靜脈注入HER2 陽性乳腺癌荷瘤鼠，體內熒光成像結果如圖6所示，可以看出靶向復合物HFn/anti-HER2 在24 h 左右出現明顯的腫瘤富集現象，并在48 h 左右達到峰值，之后在96 h 內都保持了良好的靶向；對照之下，HFn 在長達144 h 范圍內未出現明顯的腫瘤富集現象。此外，熒光強度測量分析（圖7）表明HFn/anti-HER2在體內表現出更長的保留時間（24～72 h）。

圖3 HFn、游離HER2抗體及靶向復合物HFn/anti-HER2的尺寸排阻凝膠色譜曲線

圖4 HFn（A）和靶向復合物HFn/anti-HER2（B）的透射電子顯微鏡圖像（比例尺：100 nm）；C為通過動態光散射獲得的HFn和靶向復合物HFn/anti-HER2的頻率曲線

表1 HFn和靶向復合物HFn/anti-HER2的直徑、多分散指數（PDI）及Zeta電勢（x±s，n=3）

圖5 細胞熒光實驗檢測HFn及靶向復合物HFn/anti-HER2對乳腺癌細胞的腫瘤靶向性

3 討論

納米材料靶向成像及載藥是近年來的研究熱點，其可通過增強滲透滯留（enhanced permea?bility and retention，EPR）效應及與主動靶向方式靶向腫瘤[17-18]。鐵蛋白作為一種生物納米材料具有良好的生物相容性，無免疫原性，并且其內部空腔可以作為藥物載體裝置，因此在腫瘤的診斷與治療方面展現了優勢[19-20]。作為備受關注的天然藥物載體，如何對鐵蛋白進行修飾以提高其靶向性，一直是研究的熱點。目前提高其靶向性主要通過靶向修飾配體、抗體，但未將其與臨床常用靶向治療分子連用。目前單克隆抗體的靶向性和特異性受到研究者青睞[21]，因此，利用抗體結合提升鐵蛋白的靶向性是適當可行的思路。HER2 是HER2 陽性乳腺癌靶向治療的關鍵靶點，作為模型抗體具有很高的研究和臨床價值。

圖6 HER2陽性乳腺癌荷瘤鼠的腫瘤靶向性成像

圖7 HFn和靶向復合物HFn/anti-HER2在HER2陽性乳腺癌荷瘤鼠模型中的熒光強度分析

我們利用HER2 抗體對腫瘤的高靶向特性，將人重鏈鐵蛋白作為藥物或試劑載體與之相連，發揮HER2 抗體的良好腫瘤靶向性及鐵蛋白的載體特性，構建一個靶向復合物納米載體平臺。本研究探討了人重鏈鐵蛋白與臨床常用HER2 抗體連用的可能性，人重鏈鐵蛋白可以與HER2 抗體以1∶1.3的比例連接，在體內靶向腫瘤成像時，成像平均熒光強度在48 h 達到最強，靶向性是重鏈鐵蛋白本身的3 倍，說明鐵蛋白的靶向性增加，有利于將其進行臨床轉化，具有研究價值和開發潛能。有文獻報道，修飾后的鐵蛋白可以裝載更多的化療藥物或成像分子，且擁有較長的循環半衰期，故能更好地用于腫瘤的治療[8]。本研究運用熒光標記檢測，在體內外觀察到良好的靶向性，關于載藥后成像及治療還在進一步研究中。

綜上，我們構建了人重鏈鐵蛋白-抗體偶聯物，人重鏈鐵蛋白作為藥物載體，臨床常用抗體作為靶向分子，極大地提升了鐵蛋白的腫瘤靶向性，增強了鐵蛋白在腫瘤診斷和治療方面的潛力，為后續鐵蛋白的臨床轉化提供了可行思路。