報(bào)告基因法在生物技術(shù)藥物活性檢測(cè)中的應(yīng)用

牛安娜，蘇昕，張曉鵬

1.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

報(bào)告基因法（reporter gene assays，RGA）是通過分子生物學(xué)手段，將報(bào)告基因整合入待測(cè)的生物系統(tǒng)中，繼而通過檢測(cè)報(bào)告基因產(chǎn)生的信號(hào)，研究特定生物學(xué)過程的方法。從廣義上講，利用熒光蛋白觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率，或者利用抗性基因篩選陽性克隆都屬于報(bào)告基因法。具體而言，報(bào)告基因與目的基因或調(diào)控序列相連，通過檢測(cè)報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的活性，直觀反映細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄活性或表達(dá)水平[1]。比如將報(bào)告基因置于特定啟動(dòng)子調(diào)控序列之后，可研究某種條件下啟動(dòng)子的調(diào)控或特定基因調(diào)控下目的蛋白的表達(dá)。作為報(bào)告基因，其序列和功能一般均已得到鑒定，最重要的是其表達(dá)產(chǎn)物易于被檢測(cè)。報(bào)告基因法的應(yīng)用非常廣泛[2]，常用于信號(hào)通路分析、受體功能鑒定、生物大分子相互作用及藥物篩選等領(lǐng)域[3]。

1 報(bào)告基因法的發(fā)展近況

近些年，隨著生物技術(shù)藥物的蓬勃發(fā)展，報(bào)告基因法逐漸應(yīng)用于生物藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)之中。一般是在充分理解藥物的分子藥理機(jī)制的基礎(chǔ)上，建立相應(yīng)的細(xì)胞模型，利用報(bào)告基因表征待測(cè)藥物參與的、特定的信號(hào)通路的激活，產(chǎn)生生物效應(yīng)，從而反映藥物的生物學(xué)活性。

以干擾素為例，早期就有應(yīng)用報(bào)告基因測(cè)定干擾素活性的研究[4]。在2015年版《中國藥典》中，報(bào)告基因法被收錄為Ⅰ型干擾素活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[5]。繼干擾素后，重組人促紅細(xì)胞生成素[6]、促胰島素分泌肽融合蛋白[7]、抗血管內(nèi)皮生長因子抗體[8]、程序性凋亡受體1 抗體[9]和抗白細(xì)胞介素5 抗體[10]等生物制品相繼建立了基于報(bào)告基因的生物學(xué)活性檢測(cè)方法?；趫?bào)告基因的生物學(xué)活性測(cè)定方法的應(yīng)用范圍正在不斷擴(kuò)大，應(yīng)用前景廣闊。

表1總結(jié)了近年來文獻(xiàn)報(bào)道的基于報(bào)告基因法的生物技術(shù)藥物活性檢測(cè)方法。可以看到，報(bào)告基因法的應(yīng)用基本涵蓋了生物藥物的各種類型，包括細(xì)胞因子、激素、融合蛋白藥物、抗體等。

2 生物學(xué)活性檢測(cè)與報(bào)告基因法

生物學(xué)活性是藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一[23]，是藥物有效性的保證。不同的藥品具有不同的生物學(xué)活性（表1）。生物學(xué)活性檢測(cè)也稱為效力測(cè)定或生物測(cè)定，就是用適當(dāng)?shù)姆椒?，定性或定量地反映生物學(xué)活性。而為了藥物評(píng)價(jià)的需要，一般要采用定量方法得到藥物產(chǎn)生特定生物學(xué)效應(yīng)的具體量值。

從表1可以看到，利用報(bào)告基因法進(jìn)行藥物活性測(cè)定基本都是在活細(xì)胞體系上通過基因工程構(gòu)建報(bào)告細(xì)胞系來建立的。基于細(xì)胞的活性檢測(cè)方法有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：相較于生化反應(yīng)，它更能體現(xiàn)藥物的生物學(xué)活性[24]；而相對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)又表現(xiàn)出更好的重復(fù)性、易操作性和更低的人力、物力、時(shí)間成本。

報(bào)告基因法與基于細(xì)胞水平的活性測(cè)定相得益彰。藥物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答，這個(gè)過程中涉及特定信號(hào)通路的活化和傳導(dǎo)。而報(bào)告基因法則可以通過報(bào)告基因信號(hào)的檢測(cè)，快速表征相關(guān)信號(hào)的激活，從而反映藥物相應(yīng)的生物學(xué)活性。

報(bào)告基因法應(yīng)用于生物制品活性檢測(cè)有如下優(yōu)勢(shì)。一是快速。表1中各個(gè)生物制品相關(guān)的報(bào)告基因法基本可在1 d 內(nèi)完成檢測(cè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)方法。以干擾素為例[4]，傳統(tǒng)的噬斑法要從病毒感染到觀察到細(xì)胞病變，至少需要2 d。從這個(gè)角度而言，快速的報(bào)告基因法不僅能夠極大地降低時(shí)間成本，最重要的是提高了藥物研發(fā)的效率。二是方法變異度小。以表1中抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體的生物學(xué)活性檢測(cè)為例，報(bào)告基因法的精密度和準(zhǔn)確性都較高（變異系數(shù)CV 均小于10%），而傳統(tǒng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖法精密度和準(zhǔn)確性的CV 都小于15%[8]。較小的變異度意味著測(cè)定結(jié)果更為真實(shí)、可靠。三是能夠反映藥品生物學(xué)活性的分子機(jī)制。中國藥典和美國藥典均指出，藥物活性測(cè)定的方法應(yīng)盡可能反映或模擬藥物預(yù)期的作用機(jī)制[5,25]，若測(cè)定方法不能反映功能相關(guān)作用機(jī)制，則需要證明其他測(cè)定方法與生物活性測(cè)定方法相關(guān)。一個(gè)成功的報(bào)告基因活性測(cè)定方法，正是利用了藥品活性相關(guān)的信號(hào)通路，從而能夠直觀地反映藥物的作用機(jī)制。

表1 報(bào)告基因檢測(cè)在生物藥物活性檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

3 報(bào)告基因法的要素

用于生物學(xué)活性檢測(cè)的報(bào)告基因法在建立之初主要考慮3 個(gè)要素：檢測(cè)用細(xì)胞、待測(cè)的報(bào)告基因，以及涉及的信號(hào)通路的選擇。

3.1 檢測(cè)用細(xì)胞的選擇

為了檢測(cè)方法的穩(wěn)定性，檢測(cè)所用細(xì)胞一般選用能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系或細(xì)胞株，以方便報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因操作和細(xì)胞的克隆化。由原代細(xì)胞或不穩(wěn)定的細(xì)胞系構(gòu)建的報(bào)告細(xì)胞，無法保證本次檢測(cè)時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)一致，也就無法準(zhǔn)確、定量地反映待測(cè)藥品的質(zhì)量。同時(shí)，檢測(cè)用細(xì)胞還要盡量考慮是待測(cè)藥物的靶細(xì)胞，藥物刺激與靶細(xì)胞產(chǎn)生的變化相關(guān)，這樣能更加真實(shí)地反映待測(cè)藥物的活性，也便于與其他方法進(jìn)行比較。例如，在測(cè)定抗白細(xì)胞介素6（IL-6）/IL-6 受體（IL-6R）抗體藥物的生物學(xué)活性研究中，作者選用IL-6 依賴的DS-1 細(xì)胞作為測(cè)定的靶細(xì)胞[21]。DS-1 是 IL-6 依賴的 B 淋巴細(xì)胞，只能在 IL-6 存在的條件下存活。靶表面含IL-6R，能與IL-6 結(jié)合激活下游信號(hào)通路，在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用?？笽L-6/IL-6R 抗體藥物可阻斷IL-6/IL-6R 相互作用，用于治療免疫相關(guān)疾病。選用DS-1 作為靶細(xì)胞更能真實(shí)地模擬抗IL-6/IL-6R 抗體藥物作用的機(jī)制。

3.2 報(bào)告基因的選擇

報(bào)告基因是編碼基因，其編碼產(chǎn)物可以是某些蛋白或酶類[26]。迄今發(fā)展的報(bào)告基因種類很多，在不同領(lǐng)域的應(yīng)用也非常廣泛。選擇報(bào)告基因的原則，一是要考慮報(bào)告基因的表達(dá)是否對(duì)宿主細(xì)胞有影響，是否有內(nèi)源性活性的干擾[27]；二是要考慮報(bào)告基因檢測(cè)信號(hào)的類型和相應(yīng)的檢測(cè)方法是否成熟。

常用的報(bào)告基因有CAT（氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶）、SEAP（分泌型堿性磷酸酶）、GFP（綠色熒光蛋白）、β-半乳糖苷酶、GUS（葡萄糖醛酸酶）等[28]。但如表1所示，生物制品活性測(cè)定中多采用螢光素酶基因作為報(bào)告基因。相對(duì)于其他報(bào)告基因，螢光素酶具有諸多優(yōu)勢(shì)：檢測(cè)靈敏度高，如螢火蟲螢光素酶的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10-20mol[29]，靈敏度約為CAT的100 倍，信號(hào)半衰期可維持?jǐn)?shù)小時(shí)；檢測(cè)范圍寬，可達(dá)7～8 個(gè)數(shù)量級(jí)[30]；與β半乳糖苷酶相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞無內(nèi)源性螢光素酶活性[31]；有多種商品化螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)可選。

3.3 細(xì)胞信號(hào)通路的選擇

藥物作用于細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多種效應(yīng)，最終表現(xiàn)可能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，或抑制細(xì)胞增殖、產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)或抗病毒效應(yīng)等[32]。在分子層面上，這些表型的背后勢(shì)必涉及多條信號(hào)通路的協(xié)同、競爭和整合。因此，應(yīng)盡量選擇與最終細(xì)胞表型相關(guān)、最能反映藥品藥理性質(zhì)的通路。這就要求對(duì)藥品的作用機(jī)制有全面的理解。如若不然，選擇其他通路雖然也能反映藥物活性，但是違背了藥典的“應(yīng)盡可能反映或模擬產(chǎn)品預(yù)期的作用機(jī)制”的原則。例如，在采用螢光素酶報(bào)告基因法篩選5-羥色胺（5-HT）受體藥物介導(dǎo)信號(hào)通路的研究中[33]，作者詳細(xì)比較了藥物刺激后 3 種相關(guān)信號(hào)通路 SRE、CRE、NAFT 引起細(xì)胞效應(yīng)的變化，分別得到了不同的信噪比和半數(shù)有效量。結(jié)果顯示，相比較于NFAT-Luc，CRE-Luc與SRE-Luc 方法的信噪比較高。但由于SRE-Luc易受細(xì)胞培養(yǎng)基中血清的干擾而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而CRE-Luc 不受血清影響，更能反映受體激活狀態(tài)，因此最終選擇CRE-Luc 信號(hào)通路用于篩選不同的5-HT 受體激動(dòng)劑和抑制劑。

4 報(bào)告基因法在生物藥物研發(fā)中的應(yīng)用

基于報(bào)告基因法檢測(cè)藥品生物學(xué)活性，除了可用于最終產(chǎn)品質(zhì)量的檢定和放行[34]，也可用于生物制藥的各個(gè)階段。

可用于早期候選分子的設(shè)計(jì)與篩選。由于報(bào)告基因法簡單快速，可以構(gòu)建相應(yīng)的高通量篩選方法[35]。如高通量篩選γ-珠蛋白基因的激活劑，利用螢光素酶雙報(bào)告基因法，從約15 000 個(gè)化合物的庫中篩選得到1072 個(gè)具有生物學(xué)活性的化合物，在此過程中報(bào)告基因的檢測(cè)用時(shí)約2 h，極大地提高了藥物的篩選效率[36]。

可用于生物制品生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。在生產(chǎn)工藝建立和優(yōu)化的過程中，經(jīng)常需要摸索大量實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)不同條件下獲得的樣品進(jìn)行檢測(cè)，隨后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。這一過程中生物學(xué)活性檢測(cè)往往是限速步驟。報(bào)告基因法的引入可以很好地解決這個(gè)問題，而且適用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究方法[37]。

更為重要的是，報(bào)告基因法靈敏度高，可以檢測(cè)到因生產(chǎn)工藝變化帶來的對(duì)產(chǎn)品生物學(xué)活性的微小影響。不同生產(chǎn)工藝會(huì)影響蛋白翻譯后修飾[38]，進(jìn)而造成產(chǎn)品的生物學(xué)活性變化。這些變化一般很小，常規(guī)活性檢測(cè)方法由于方法本身變異度較大，會(huì)掩蓋掉這些微小差異。因此，在本階段采用報(bào)告基因法進(jìn)行活性檢測(cè)，可以使生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和質(zhì)量研究更加有效。

5 結(jié)語

生物學(xué)活性測(cè)定方法多種多樣，發(fā)展迅速，而報(bào)告基因檢測(cè)方法可通過報(bào)告基因直觀地反應(yīng)藥物的生物學(xué)活性及更深層的藥物作用機(jī)理，目前已應(yīng)用到許多藥物的生物學(xué)活性檢測(cè)中。近年來報(bào)告基因法也應(yīng)用于免疫和腫瘤藥物領(lǐng)域，如一些腫瘤相關(guān)的免疫抑制檢查點(diǎn)藥物活性檢測(cè)也應(yīng)用報(bào)告基因法反映藥物的活性和作用機(jī)制。由于報(bào)告基因法具有快速、靈敏及易于高通量的特點(diǎn)，利用其檢測(cè)生物制品的生物學(xué)活性，可以應(yīng)用于從靶點(diǎn)篩選、生產(chǎn)工藝驗(yàn)證到終產(chǎn)品的質(zhì)量控制等藥物研究的各個(gè)階段，加速藥物的研發(fā)。報(bào)告基因法還可以反映藥物的分子機(jī)制，從而更加準(zhǔn)確地表征其生物學(xué)活性。在我國生物制品研究快速發(fā)展的今天，報(bào)告基因法的應(yīng)用有利于生物制品質(zhì)量體系的建立和規(guī)范，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。