M2型巨噬細胞在移植腎上皮-間質轉化中的作用

楊迷玲,徐憲偉,張 果,曲青山,楊金花*

(鄭州人民醫院 1.病理科;2.器官移植科,河南鄭州 450003)

腎移植是腎功能衰竭患者的有效治療手段。目前,移植腎的1年存活率已經普遍超過90%,但移植腎的長期存活狀況并沒有明顯改善[1]。慢性移植腎腎損傷(chronic kidney allograft injury,CAI)是腎移植后常見的并發癥,主要表現為移植腎功能進行性減退,最終可導致腎功能衰竭。CAI的組織學特征為非特定因素所致的間質纖維化和腎小管萎縮。預防CAI是提高移植腎存活率的主要目標之一,有研究認為炎癥性巨噬細胞(M2)與移植腎的間質纖維化相關,而上皮-間質轉化(epithelial-interstitial transformation,EMT)是腎間質纖維化的主要因素,但是M2型巨噬細胞與移植腎EMT之間的關系尚不清楚。因此,我們初步用免疫組織化學方法檢測移植腎組織中CD163和EMT標記物腫瘤生長因子(Tumor growth fanctor,TGF-β1)、E-cadherin、Vimentin及SMA蛋白的表達情況,進一步分析CD163標記的M2型巨噬細胞與移植腎腎小管上皮-間質轉化之間的關系及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 選取鄭州人民醫院病理科2014-2017年病理診斷為慢性移植腎腎損傷的石蠟標本30例,其中男性18例,女性12例,年齡18～53歲。按Banff 2015移植腎活檢診斷標準慢性移植腎腎損傷間質纖維化分3級：Ⅰ級12例,Ⅱ級10例,Ⅲ級8例,用Masson三色染色評估間質纖維化來選取標本。同時收集10例正常腎組織作為對照組。在選取標本時已除外其他已知原因引起的間質纖維化和腎小管萎縮,只選取非特定致病因素引起的間質纖維化和腎小管萎縮,不伴有腎小管炎和動脈內膜炎。

1.1.2主要試劑 鼠抗人單克隆抗體CD163(克隆號10D6)、鼠抗人單克隆抗體SMA(克隆號1A4)、兔抗人多克隆抗體TGF-β1、鼠抗人單克隆抗體E-cadherin(克隆號4A2C7)、鼠抗人單克隆抗體Vimentin(克隆號V9)均購自福州邁新公司。

1.2 方法所有組織標本均經10%福爾馬林固定,石蠟包埋,3 μm厚連續切片,然后用免疫組織化學EliVision法染色。免疫組化操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。預處理：CD163、Vimentin和E-cadherin采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 6.0)高溫高壓修復,TGF-β1采用EDTA高溫高壓修復；SMA無需修復。經DAB顯色,蘇木素復染,鹽酸乙醇分化,氨水返藍,脫水,透明,封片。以PBS代替一抗作陰性對照,已知陽性切片作陽性對照。

1.3 結果判定所有結果由有經驗的腎臟移植病理醫師判定。

用Masson三色染色來評估間質纖維化程度,在400倍鏡下,每張切片隨機選取25個視野,陽性染色面積占整個區域的比值即為纖維化的程度[2]。按Banff 2015[3]移植腎活檢診斷標準分3級，Ⅰ級：輕度間質纖維化,累及范圍<25%的腎實質；Ⅱ級：中度間質纖維化,累及范圍達到26%～50%的腎實質；Ⅲ級：重度間質纖維化,累及范圍50%的腎實質。

免疫組化結果的判讀：CD163標記M2型巨噬細胞,胞質棕黃色判讀為陽性,在400倍鏡下,每張切片至少連續計數9個高倍視野,再取其平均值[4]。TGF-β1表達于腎小管上皮細胞的胞質,呈棕黃色；E-cadherin陽性著色位于腎小管上皮細胞的胞膜,棕黃色,為上皮標記物；Vimentin表達于間質和腎小管上皮細胞的胞質,為間質標記物；SMA標記活化的肌纖維母細胞,胞質棕黃色為陽性。陽性區域計算方法：在200倍鏡下,每張切片至少計數6個中倍視野的腎實質,避開腎小球和大血管。將所選視野用蔡司顯微鏡進行拍照,再將圖片輸入Imagepro plus 6.0圖像處理軟件對圖片進行定量檢測各種蛋白的平均光密度值,即為TGF-β1、E-cadherin、Vimentin和SMA的相對表達量。

2 結 果

2.1 CD163、TGF-β1、E-cadherin、Vimentin和SMA在移植腎組織和正常腎組織中的表達CD163標記的M2型巨噬細胞、TGF-β1、Vimentin和SMA在移植腎組織中的表達顯著高于正常腎組織,并且隨著移植腎間質纖維化程度的加重,它們的相對表達量也逐漸增多,差異具有統計學意義(P均<0.05,表1、圖1)。

上皮標記物E-cadherin在移植腎腎小管上皮細胞中的表達顯著低于正常腎組織,并且隨著移植腎間質纖維化級別的升高其表達逐漸減少,差異具有統計學意義(P<0.05,表1、圖1)。

2.2 患者血肌酐和血尿素氮水平與移植腎組織間質纖維化程度的關系患者的血肌肝(creatinine, Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)平均值隨移植腎間質纖維化程度的增加而升高,與正常人的血Cr相比,差異具有統計學意義(P<0.01，表2)。

表1 各級纖維化的移植腎組織中SMA、CD163、E-cadherin、TGF-β1和Vimentin的相對表達

纖維化程度例數SMACD163E-cadherinTGF-β1Vimentin正常102.90±1.192.70±2.0567.06±10.221.20±0.64 2.66±3.35Ⅰ級1221.00±2.6991.50±25.3633.14±7.3051.56±20.5994.52±14.31Ⅱ級1039.00±4.6263.10±51.2518.34±3.00136.02±16.16138.05±11.83Ⅲ級863.75±9.22394.75±124.619.61±0.89214.02±17.35273.10±23.65F值246.872.7134.9316.4535.8P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

圖1 移植腎組織間質纖維化程度及CD163、TGF-β1、SMA、E-cadherin和Vimentin在移植腎組織中的表達情況

A ：三色染色顯示移植腎組織間質纖維化 (Masson,×200)；B：移植腎組織中M2型巨噬細胞在間質中的聚集(EliVision,×200)；C：移植腎組織腎小管上皮細胞胞質TGF-β1陽性表達(EliVision,×200)；D：移植腎組織間質標記物SMA陽性表達(EliVision,×200)；E：移植腎組織腎小管上皮細胞E-cadherin表達情況,部分腎小管上皮細胞E-cadherin表達缺失(EliVision,×200)；F：移植腎組織腎小管上皮細胞間質標記物Vimentin陽性表達(EliVision,×200)。

表2 患者血肌酐、BUN與移植腎纖維化程度的關系

纖維化程度nCr(μmol/L)BUN(mmol/L)正常1065.8±3.994.87±0.84Ⅰ級12172.75±24.5516.78±2.19Ⅱ級10266.20±27.9928.10±3.07Ⅲ級8447.88±48.5242.88±4.52F值277.4297.9P<0.001<0.001

Cr:肌酐；BUN：血尿素氮

2.3 移植腎組織中M2型巨噬細胞數量與TGF-β1、E-cadherin、Vimentin和SMA表達及血Cr的相關性隨著移植腎間質纖維化級別的升高,M2型巨噬細胞的數量逐漸增多,腎小管上皮細胞中TGF-β1和Vimentin及間質SMA相對表達量也逐漸增多,而腎小管上皮細胞中的E-cadherin則逐漸減少。M2巨噬細胞的數量與血Cr水平呈正相關(r=0.937,P<0.01,圖2)。

圖2 移植腎組織中CD163陽性的M2巨噬細胞的數量與上皮間質轉化各指標及患者患者血清Cr水平的相關性

A：與間質SMA相對表達量的相關性；B：與腎小管上皮細胞Vimentin相對表達量的相關性；C：與腎小管上皮細胞E-cadherin相對表達量的相關性；D：與腎小管上皮細胞TGF-β1相對表達量的相關性；E：與患者血清Cr水平的相關性。

3 討 論

由于免疫抑制劑的合理應用和手術水平的提高,腎移植已成為挽救腎功能衰竭患者生命的的重要手段。目前,腎移植近期效果已得到顯著的改善,但遠期效果仍有待提高。CAI的發病機制還不清楚。巨噬細胞在多種腎疾病中聚集是一種普遍現象,包括炎癥性、非炎癥性腎疾病和移植腎損傷。研究表明巨噬細胞可以被極化成兩種不同的表型,即M1和M2。M1型巨噬細胞具有促炎表型,其特征主要表現為產生多種促炎癥細胞因子,抵抗病原入侵,同時也會造成機體損傷,常見的M1型巨噬細胞標志物有iNOS、CD86、CD16/32、白細胞介素-1受體(interleukin-1 receptor,IL-1R)等；而M2型巨噬細胞則是替代途徑活化的巨噬細胞,被認為是抗炎表型,常與組織修復有關,常見M2型巨噬細胞標志物有CD163、CD206、CD301等。隨著巨噬細胞吞噬凋亡細胞,M1型可轉化為M2型,后者可以產生IL-10和TGF-β,誘導肌纖維母細胞的增殖,促進纖維化的發生。調節從M1到M2轉換的關鍵巨噬細胞受體是CD163,它是血紅蛋白清道夫受體[5-8]。

研究表明CD163陽性的M2型巨噬細胞與多種腎臟疾病的慢性損傷有關,比如在糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)中,腎間質浸潤的M2型巨噬細胞與腎間質纖維化、腎小管萎縮、DN分級和腎功能損傷有關[9]。有人用小鼠單側輸尿管梗阻模型研究發現腎損傷后募集的巨噬細胞極化為M2型,M2型巨噬細胞可以促進腎纖維化。消除M2型巨噬細胞可特異性地抑制腎纖維化,而消除M1型巨噬細胞則無此作用[2]。最近有一項關于巨噬細胞極化在移植腎抗體介導的排斥反應的研究,實驗分兩組,M1型巨噬細胞極化組和M2型巨噬細胞極化組,結果發現M2型巨噬細胞極化組慢性移植性腎小球病變評分和血肌酐明顯升高,而腎小球率過濾明顯降低,與M1極化組比較,差異有顯著性意義[10]。本研究結果顯示CD163標記的M2型巨噬細胞在移植腎組織中的數量顯著高于正常腎組織,并且隨著移植腎間質纖維化程度的加重,M2巨噬細胞的數量也逐漸增多,與前述研究結果一致,說明M2型巨噬細胞在移植腎間質纖維化的發展中也起著一定的作用。

M2型巨噬細胞是如何促進移植腎間質纖維化發生發展的呢？眾所周知,EMT在腎間質纖維化中起著重要作用。在EMT過程中,腎小管上皮細胞失去上皮細胞特性,上皮標記物E-cadherin表達減少,獲得間質表型,遷移能力增強,這些轉化的細胞從腎小管的微環境轉移至間質內,促進腎纖維化的發生發展,同時成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞,這些細胞表達間質標記物SMA。有人將纖維母細胞與順鉑處理過的腎小管上皮細胞共培養發現,順鉑只能誘導腎小管上皮細胞發生不完全的EMT,而加入含有M2型巨噬細胞的培養基可以使順鉑誘導腎小管上皮細胞發生完全的EMT,進一步引起腎小管間質纖維化[11]。有兩個TGF-β超家族成員是腎小管上皮細胞可塑性的關鍵調節者：TGF-β1和BMP7,TGF-β1是EMT的潛在誘導者[12]。吳蓮鳳等[13]研究發現M1型巨噬細胞可通過誘導TNF-α高表達促進腎組織早期炎癥損傷,M2型巨噬細胞通過提高TGF-β1水平促進后期纖維增生性修復。另有研究表明,在輸尿管梗阻早期腎臟中募集的巨噬細胞主要是M1型,然而,這些細胞很快極化為M2型巨噬細胞,后者釋放大量的TGF-β1來提高EMT誘導的腎纖維化[14]。本研究結果顯示：移植腎組織腎小管上皮細胞中TGF-β1和間質標記物SMA的表達顯著高于正常腎組織,并且隨著移植腎間質纖維化級別的升高而增多,而上皮細胞標記物E-cadherin的表達則逐漸減少,同時發現間質標記物Vimentin表達于CAI患者的腎小管上皮細胞中,并且隨著損傷程度加重其表達逐漸增多。這說明在移植腎間質纖維化的發生發展過程中腎小管上皮細胞發生了EMT,TGF-β1與移植腎腎小管EMT有關。相關性分析顯示移植腎組織中M2型巨噬細胞與TGF-β1、Vimentin和SMA的表達呈正相關,與患者血清Cr的平均值呈正相關,而與E-cadherin呈負相關,結合前人研究我們推測M2型巨噬細胞可能通過提高TGF-β1的表達水平來促進移植腎發生EMT,進一步促進移植腎間質纖維化,引起患者腎功能不全。

以往關于M2型巨噬細胞在腎臟EMT中的作用多集中在原發腎疾病或移植腎動物模型上,本研究初步探討了M2型巨噬細胞在慢性移植腎腎損傷EMT中的作用,結果顯示M2型巨噬細胞可以促進移植腎EMT的發生,引起腎纖維化和患者的腎功能不全,并且這一作用我們結合前人研究推測可能是通過提高TGF-β1的表達水平來誘導的。因此,我們認為在臨床腎移植工作中可以定期檢測移植腎組織中M2型巨噬細胞的聚集情況來預測腎移植患者間質纖維化發生的可能性,對臨床防止慢性移植腎腎損傷有著重要意義。