頭穴叢刺聯合多奈哌齊對阿爾茨海默病大鼠海馬及皮層區ChAT及AchE活性的影響

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)作為老年期癡呆最常見的癡呆類型,其發病過程極為隱匿,記憶力減退是首發癥狀且進行性加重。截至2015年,我國癡呆人數居世界之最,高達950萬,同時預計到2050年癡呆人數將突破1.31億[1-2]。在AD前期發展過程中,膽堿能神經元損傷在認知功能下降中扮演著不可或缺的角色,與Aβ沉積并存[3]。本研究通過Aβ誘導老年癡呆模型,頭穴叢刺觀察治療前后AD大鼠海馬及皮層區乙酰膽堿轉移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AchE)活性變化,從而進一步探討其作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體質量為250～300 g的60只Wistar大鼠均由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供,普通環境喂養,隨機分為4組:假手術組、模型組、治療組、對照組,每組15只。

1.2 試驗藥物、試劑和儀器 多奈哌齊(安理申)由PFIZER PGM公司生產制造,產品批號:5136903,5 mg/片;Aβ1-42由美國Sigma公司生產;Moirrs水迷宮系統(成都泰盟科技有限公司);DW-5立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備:10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉,固定于大鼠腦立體定位儀上,常規顱頂部剃毛消毒,暴露頭部皮膚沿頭部中線剪開,仔細將骨膜剔除充分暴露頭骨,選擇雙側海馬CA1區為注射靶區(前囟點向后3.6 mm,旁開2.7 mm),鉆孔后將10 mL Aβ1-42寡聚體注入其中,每側5 mL,拔針后清創縫合消毒防止感染[4]。

1.3.2 干預方法:假手術組:假手術組每側海馬區注射5 mL蒸餾水。模型組:造模后同等抓握和喂養。對照組:造模后3 d,參照“人和動物間按體表面積折算的等劑量比值表”給予安理申0.45 mg/(kg·d)灌胃治療。治療組:造模3 d后,在安理申灌胃基礎上根據于致順教授頭部七區劃分法,參考《大鼠穴位圖譜》所示,定位大鼠神庭穴、百會穴及其左右各旁開2 mm處,選用0.25 mm×25 mm針灸針進行針刺,針刺方向從后往前(百會透神庭),快速捻轉1 min,1次/d,每次2 h,干預周期為4周,每周日休息1 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 Morris水迷宮檢測:于針灸治療結束后次日開始,歷時5 d[5]。

1.4.2 HE染色:觀察海馬及皮層區組織病理形態學變化。

1.4.3 海馬及皮層區ChAT、AchE活性的變化:采用比色法觀察,具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1 水迷宮實驗結果 模型組與假手術組相比,大鼠的逃避潛伏期被延長,第二象限百分比和跨越平臺次數減少,差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組相比,對照組與治療組都大大縮短了AD大鼠逃避潛伏期,增加了第二象限百分比及跨越平臺的次數(P<0.05,P<0.01);且治療組優于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結果比較

注：與假手術組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與對照組比較,△P<0.05

2.2 海馬及皮層區組織病理形態學影響

2.2.1 海馬區:假手術組大鼠海馬區神經細胞布列趨勢較緊密,神經元形態尚規則,無組織水腫,散見少量凋亡小體和炎性細胞,血管無充血。模型組大鼠海馬區神經細胞布列趨勢紊亂,神經元形態欠規則,膠質細胞數目顯著增加,可見大量神經元凋亡小體和炎性細胞,毛細血管腫脹。治療組、對照組大鼠海馬區病理改變較模型組有明顯改善。主要表現為各組大鼠海馬區疏松程度明顯減輕,神經元細胞核固縮數目、膠質和炎細胞數目明顯減少,毛細血管腫脹減輕,神經細胞布列趨勢相對緊密。見圖1。

2.2.2 皮層區:假手術組細胞形態尚規則,結構相對正常。模型組神經元形態欠規則,數目減少,膠質細胞數目增多。治療組、對照組大鼠皮層區病理改變較模型組有明顯改善。主要表現在神經細胞布列較規則,數目顯著增多,膠質細胞減少明顯。見圖2。

圖1 各組大鼠海馬區組織病理形態比較(HE染色,×400)

圖2 各組大鼠皮層區組織病理形態比較(HE染色,×400)

2.3 頭穴叢刺對AD大鼠海馬及皮層ChAT活性的影響 與假手術組比較,模型組海馬皮層區ChAT水平下降(P<0.01);對照組海馬和皮層區ChAT水平與模型組差異無統計學意義(P>0.05),治療組海馬皮層區ChAT水平與模型組、對照組相比均升高(均P<0.01)。

假手術組海馬和皮層區ChAT水平比較差異無統計學意義(P>0.05);模型組、對照組海馬和皮層區ChAT水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05),海馬區水平低于皮層區;治療組海馬和皮層區ChAT水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 頭穴叢刺對AD大鼠海馬及皮層AchE活性的影響 與假手術組相比,模型組海馬皮層區AchE水平顯著上升(P<0.01);與模型組相比,治療組、對照組海馬和皮層區AchE水平均下降(P<0.01或P<0.05);與對照組相比,治療組海馬皮層區AchE水平下降(P<0.01或P<0.05)。

圖3 各組ChaT水平比較

假手術組海馬和皮層區AchE比較差異無統計學意義(P>0.05);模型組、對照組海馬和皮層區AchE水平比較差異有統計學意義(均P<0.05),海馬區水平高于皮層區;治療組海馬和皮層區。AchE水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組AchE活性比較

3 討論

Aβ假說是AD主流假說之一,該假說認為超出常量的具有神經毒性的Aβ在癡呆病人腦內異常堆積,引起老年斑、神經纖維纏結和炎癥反應,最終造成神經凋亡[6]。Aβ1-42誘導的AD大鼠模型是被公認的較為成功的老年癡呆模型,該模型不僅出現癡呆病人該有的記憶缺損下降,同時兼具癡呆病人腦內神經病理學特征,已被廣泛接受[7-8]。實驗中Aβ用于腦內注射的主要成分為Aβ1-40、Aβ25-35、Aβ1-42(毒性最強)。與Aβ1-40相比Aβ1-42疏水性更強,更利于淡粉樣斑塊沉積,相對于Aβ25-35,Aβ1-42神經纖維纏結更易于形成，且Aβ1-40、Aβ25-35誘導的AD的模型持續時間較短,因此Aβ1-42被運用于誘導老年癡呆模型更加貼近老年癡呆病人病理表現,模型更易于成功[9]。膽堿能神經元由于在腦內分布廣泛,主要包括基底前腦膽堿能神經元、紋狀體等,因此其支配著幾乎所有的腦區[2]。而膽堿能損傷假說也是其發病的重要機制之一。乙酰膽堿(Ach)作為一種中樞膽堿能神經遞質與AD的發生密切相關,Ach的含量與ChAT和AchE的活性相關:ChAT能夠促進Ach的合成而AchE卻能分解Ach,兩者共同維持著Ach的動態平衡[10]。上調ChAT活性和下調AchE活性是協調機體內Ach平衡的唯一途徑[11]。本研究發現Aβ1-42模型大鼠能迅速地出現腦內Aβ過度沉積,形成顯著的學習記憶低下問題,海馬及皮層區的ChAT的活性下降、AchE活性升高,其中海馬區ChAT活性低于皮層區,AchE活性高于皮層區。對照組結果顯示多奈哌齊能夠明顯地抑制AchE,而對ChAT效果甚微,海馬區ChAT活性低于皮層區,AchE活性高于皮層區。治療組結果顯示頭穴叢刺聯合鹽酸多奈哌齊療效明顯優于單純對照組,不僅能夠進一步上調ChAT活性,下降AchE活性,且ChAT、AchE活性在海馬和皮層區差異無統計學意義。頭穴叢刺是于志順教授在總結前人經驗的基礎上提出的關于“針場”和“頭部區域劃分”的頭針理論,在實驗和臨床工作中得到驗證并發揮出顯著的療效,由原先單一的點刺或是線刺擴展到面刺,不僅擴大了針刺面積同時加強了刺激量[12],并且針刺時間也大大延長,長留針不僅縮短了治療時間同時也減輕病人由于針刺造成的疼痛。本課題在前期研究中已經證實頭穴叢刺能夠調控膽堿能系統從而改善AD病人的學習記憶狀況[13]。本次實驗將多奈哌齊作為基礎藥物治療配合頭穴叢刺,發現聯合治療效果更加明確,且兩者都是通過上調ChAT活性和下調AchE活性來改善AD病人的學習記憶能力。