閩西寧化2 個鐵皮石斛品系離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

潘 紅，張 靜，賴呈純，黃賢貴，王 琦，高慧穎，

賴鐘雄1*

（1.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州350003）

鐵皮石斛（Dendrobium candidumWall.ex Lindl.）屬于蘭科石斛屬多年生草本附生植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，富含生物堿、多糖、類黃酮等活性物質(zhì)[1]。鐵皮石斛生長緩慢、自身繁殖能力低，但市場需求大，價格高。野生鐵皮石斛因被過度采挖，環(huán)境破壞，已瀕臨滅絕[2]。目前，鐵皮石斛是國家重點保護藥用植物、中國珍稀瀕危二級保護植物，已被列入中國植物保護紅皮書[3]。鐵皮石斛的自然分布區(qū)域非常廣，生長環(huán)境差異較大，由此出現(xiàn)明顯的種類變異，不同產(chǎn)地鐵皮石斛莖表面的紫色斑點分布情況不同，有些紫色斑點少，密度較小，顏色淺，即稱“青桿鐵皮”；而有些產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛莖紫色斑點較多，密度大，顏色呈紫紅色，即稱“紅桿鐵皮”[4]。紅桿鐵皮石斛的藥用價值高于青桿鐵皮石斛[5]，更受到消費者的青睞。不同品種的植物生長狀態(tài)存在差異性，目前關(guān)于二者在組織培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出的具體差異報道較少。該試驗通過8 種培養(yǎng)基對閩西寧化2 個鐵皮石斛品系的離體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期篩選出適合2 個品系鐵皮石斛叢生芽增殖、根系生長等的培養(yǎng)基，并比較二者之間的離體培養(yǎng)下的生長差異，從而為閩西寧化紅桿鐵皮石斛和青桿鐵皮石斛的工廠化生產(chǎn)及次生代謝產(chǎn)物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

閩西寧化紅桿與青桿2 個鐵皮石斛品系來源于福建省清流縣邱元農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司蘭花資源圃，由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所食品資源研究室通過莖段直接誘導不定芽獲得的試管苗。

1.2 方法

1.2.1 離體培養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)基配方。根據(jù)前期試驗的結(jié)果，設(shè)計了8 組培養(yǎng)基對2 個鐵皮石斛品系叢生芽增殖進行優(yōu)化，培養(yǎng)基配方如下：

T1：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；T2：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；T3：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Amp（氨芐青霉素）1 mg/L；T4：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Amp 1 mg/L；T5：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+土豆泥200 g/L；T6：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+土豆泥200 g/L；T7：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥200 g/L；T8：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥200 g/L。

含有Amp 的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40℃左右添加，搖勻分裝。香蕉泥用新鮮果實打漿而成，土豆泥用新鮮塊莖去皮打漿而成。所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH 5.8。于高壓滅菌鍋中121℃、0.11MPa 下高溫滅菌20 min。

1.2.2 接種與培養(yǎng)。切取生長狀態(tài)一致且?guī)? 個腋芽的去葉莖段，橫放接種到叢生芽增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種3 個莖段，接種5 瓶，重復3 次。培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光照強度4 000～5 000 lx，光照時間12 h/d。培養(yǎng)至60 d 統(tǒng)計紅桿和青桿鐵皮石斛叢生芽的株高、芽數(shù)和增殖系數(shù)，觀察生長狀況。

增殖系數(shù)=增殖所得叢生芽的總芽數(shù)/接種的總莖段數(shù)

1.2.3 生根壯苗培養(yǎng)。選擇生長健壯的試管苗，切取具有4～5 片真葉、3 cm 左右高度的芽苗接種于生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+1 g活性炭+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH 5.8。每瓶接種5個芽苗，接種5 瓶，重復3 次。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)至60 d，統(tǒng)計1 級根數(shù)量、2 級根數(shù)量、根系長度、叢生芽數(shù)量。對比2 個品種之間生根壯苗的差異。

1.2.4 煉苗移栽。生根壯苗培養(yǎng)試管苗生長至60 d時，進行煉苗移栽。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。運用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，利用DPS 進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛生長的影響

2.1.1 生長狀態(tài)。不同處理的培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛叢生芽生長狀態(tài)具有較大的影響。從形態(tài)上觀察，T1 培養(yǎng)基叢生芽莖段相比于T2 培養(yǎng)基較為粗壯，葉片大而濃綠（圖1A 和圖1B）。添加Amp 增殖的叢生芽，短縮細弱，叢生芽誘導不整齊一致，有的莖段只長幾個較大叢生芽，有的則緊縮成團（圖1C 和圖1D）。T5、T6 和T7、T8 培養(yǎng)基則中部分莖段黃化死亡，內(nèi)生菌大量出現(xiàn)。在培養(yǎng)過程中，T5、T6 培養(yǎng)基內(nèi)生菌增殖最為明顯，其次是T7、T8 培養(yǎng)基。T5、T6培養(yǎng)基中的紅桿鐵皮石斛葉片變短并出現(xiàn)明顯紅色（圖1E 和圖1F），T8 也出現(xiàn)葉片短小葉色變紅的現(xiàn)象（圖1H）。

2.1.2 叢生芽增殖。紅桿鐵皮石斛在不同培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)見圖2。只添加KT 和6-BA 的培養(yǎng)基T1 與T2 之間具有極顯著性差異，6-BA 有利于叢生芽的增殖。添加Amp 后，T1 培養(yǎng)基的增殖能力極顯著提高，此時T3 與T4 培養(yǎng)基之間對叢生芽增殖影響差異不大，T4 的增殖系數(shù)達到11.72，為所有優(yōu)化培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最高。T5、T6 和T7、T8 培養(yǎng)基的叢生芽增殖系數(shù)極顯著下降，之間增殖系數(shù)不存在差異性，其中T8 培養(yǎng)基增殖系數(shù)低至1.35。

圖1 紅桿鐵皮石斛在不同培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 不同培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛叢生芽增殖系數(shù)的影響

2.1.3 叢生芽株高。結(jié)合圖2、圖3 可以看出，叢生芽增殖與株高成反比。增殖系數(shù)越大，株高值越小。添加KT 的培養(yǎng)基和添加6-BA 的培養(yǎng)基在株高上具有差異性。T1 與T2 培養(yǎng)基之間株高具有極顯著性差異，KT 有促進紅桿鐵皮石斛伸長生長的作用。對比幾個添加KT 的處理，以含有KT 為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上添加Amp、土豆泥、香蕉泥并不能使紅桿鐵皮石斛株高更高。T8 培養(yǎng)基含有6-BA，其誘導的叢生芽株高與T7 對比，存在顯著性差異，香蕉泥的添加，增殖系數(shù)少，植株營養(yǎng)競爭小，都可能促進T8 培養(yǎng)基中紅桿鐵皮石斛伸長生長。

圖3 不同培養(yǎng)基對紅桿鐵皮石斛叢生芽株高的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對青桿鐵皮石斛生長的影響

2.2.1 生長狀態(tài)。不同培養(yǎng)基誘導的青桿鐵皮石斛叢生芽生長狀態(tài)存在較大差異，從形態(tài)上看，添加KT 的培養(yǎng)基，除T5 外，T1、T3、T7 培養(yǎng)基都能促使青桿鐵皮石斛伸長生長，葉色濃綠，根系生長較多（圖4M、4I、4K 和圖4O）。添加6-BA 的培養(yǎng)基，除T6外，T2、T4、T8 培養(yǎng)基都能促使青桿鐵皮石斛莖段短縮，萌發(fā)較多的叢生芽，根系較少。添加土豆泥的T5、T6 培養(yǎng)基會使內(nèi)生菌大量生長，青桿鐵皮石斛幾乎不增殖。香蕉泥的使用，青桿鐵皮石斛部分莖段死亡，叢生芽誘導少，植株葉片易變紅，但根系生長卻最為粗壯，根系上的白色絨毛多（圖4O 和圖4P）。

圖4 青桿鐵皮石斛在不同培養(yǎng)基上的生長情況

2.2.2 叢生芽增殖。從圖5 中的增殖系數(shù)中可看出，T1 與T2 培養(yǎng)基之間存在極顯著性差異，6-BA 對青桿鐵皮石斛叢生芽分化具有促進作用。T4 培養(yǎng)基最有利于叢生芽增殖，增殖系數(shù)達到32.56，與其他處理組之間存在極顯著性差異。T3 培養(yǎng)與未添加Amp的T1 處理相比，出現(xiàn)了抑制，抑制結(jié)果為極顯著性差異。與紅桿鐵皮石斛一樣，T5、T6 培養(yǎng)基和T7、T8培養(yǎng)基對叢生芽的增殖具有極顯著的抑制作用，T5培養(yǎng)基增殖系數(shù)最低為0.26。

2.2.3 株高。結(jié)合圖5、圖6 可看出，青桿鐵皮石斛叢生芽增殖系數(shù)與株高成反比。增殖系數(shù)越大，株高值越小。從數(shù)據(jù)上可以看出，KT 有促進植株增高的作用。其中添加香蕉泥的T7 培養(yǎng)基對青桿鐵皮石斛的株高產(chǎn)生了極顯著的促進作用，平均株高達到2.92 cm。T8 培養(yǎng)基含有6-BA，其株高與只添加KT 的T1 培養(yǎng)基無差異，香蕉泥能夠促進青桿鐵皮石斛的生長。

2.3 2 個品系鐵皮石斛生根壯苗的差異

結(jié)合叢生芽增殖的結(jié)果，接種的單株來源于T1培養(yǎng)基生長較高且健壯的莖段，設(shè)計了添加香蕉泥的生根培養(yǎng)基用于2 種鐵皮石斛的生根壯苗培養(yǎng)。從表1 可以看出，紅桿與青桿鐵皮石斛2 個品系間，1 級根系數(shù)存在顯著性差異，紅桿鐵皮石斛生根能力略強于青桿鐵皮石斛；2 級生根系數(shù)不存在差異；根系長度存在顯著性差異，青桿鐵皮石斛的平均根系長度較紅桿鐵皮石斛長；平均分蘗數(shù)存在顯著性差異，紅桿鐵皮石斛分蘗能力較青桿鐵皮石斛弱。從圖7 可看出，2 個品種之間生長狀態(tài)差異不明顯，均根系發(fā)達健壯，葉色濃綠，莖段較粗，生長旺盛。

2.4 煉苗移栽

圖7 2 個品系鐵皮石斛生根壯苗

表1 2 個品系鐵皮石斛生根差異性

將在生根壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d 的鐵皮石斛出瓶苗移至常溫下閉蓋煉苗3 d，再進行松蓋煉苗3 d。輕取試管苗，在清水中輕柔洗凈根部培養(yǎng)基。陰干后種植于松樹皮基質(zhì)中。定植后澆水，遮陰，每天早晚噴水，保持空氣濕度在80%左右。2 周后可見莖尖伸長，移栽成活率可在80%以上。

3 結(jié)論與討論

（1）綜合試驗數(shù)據(jù)，能夠分析出2 個品系鐵皮石斛叢生芽生長情況的差異性。青桿鐵皮石斛和紅桿鐵皮石斛在8 種優(yōu)化培養(yǎng)基所表現(xiàn)出的叢生芽增殖趨勢大致相似。6-BA 的添加對紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛的叢生芽增殖都有著極顯著的促進作用。KT 對叢生芽增殖誘導效果沒有6-BA 強，但紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛植株都表現(xiàn)出生長健壯、葉色濃綠等優(yōu)勢。在純添加激素的培養(yǎng)中，紅桿鐵皮石斛叢生芽的增殖能力小于青桿鐵皮石斛，青桿鐵皮石斛在T1 培養(yǎng)基中增殖系數(shù)是紅桿鐵皮石斛的2.11倍，青桿鐵皮石斛在T2 培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)是紅桿鐵皮石斛的1.89 倍。2 個品種共同表現(xiàn)出叢生芽增殖系數(shù)越高，相對應(yīng)的株高越矮的趨勢。紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛在T1 培養(yǎng)基、T2 培養(yǎng)基中的株高無明顯差異。

（2）植物生長調(diào)節(jié)劑在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中起到關(guān)鍵作用，紅桿鐵皮石斛在T2 培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)是T1 培養(yǎng)基的1.68 倍。青桿鐵皮石斛在T2培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)是T1 培養(yǎng)基的1.50 倍。6-BA 是最有利于叢生芽增殖的細胞分裂素，這與李玉萍等[6]、鄧成華等[7]、琚淑明等[8]報道相一致。促進伸長生長最佳細胞分裂素是KT，T1 培養(yǎng)基中生長的紅桿鐵皮石斛株高是T2 培養(yǎng)基的1.81 倍。T1 培養(yǎng)基培養(yǎng)的青桿鐵皮石斛株高是T2 培養(yǎng)基的1.50 倍。綜合試驗結(jié)果認為，誘導紅桿鐵皮石斛和青桿鐵皮石斛叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，叢生芽增殖多，且較為一致。壯苗最佳培養(yǎng)基為MS+ KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，植株莖段較粗，葉色濃綠，生長較快。在無內(nèi)生菌的情況下，可添加香蕉泥。

（3）植物內(nèi)生菌在一定階段或全階段生存于植物體內(nèi)，與植物形成一種互利共生的關(guān)系，鐵皮石斛為蘭科植物，內(nèi)生菌是普遍存在的，內(nèi)生菌在其生長過程中發(fā)揮了重要作用[9-11]。試驗材料所用的鐵皮石斛內(nèi)生菌為細菌，存在于接種前期，植株生長起來后，逐漸消失，后期肉眼觀察不到。Amp 是常見的抗生素，對抑制細菌的生長具有一定作用[12]，Amp 的添加抑制了鐵皮石斛內(nèi)生菌的生長，紅桿鐵皮石斛在添加Amp 的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出促進，T4 則極顯著的促進青桿鐵皮石斛叢生芽增殖，而生長在T3 培養(yǎng)基中出現(xiàn)了抑制，抑制原因尚不明確。土豆泥的添加使培養(yǎng)基中氮源、碳源含量增加，給內(nèi)生菌營造了良好的生長條件，內(nèi)生菌與植株間的平衡被打破，紅桿鐵皮石斛、青桿鐵皮石斛莖段易死亡，叢生芽難以誘導。也有報道稱土豆泥能夠促進植株株高生長，但不利于分蘗[13]，這在紅桿鐵皮石斛中表現(xiàn)明顯。香蕉泥也會使內(nèi)生菌增加，但增加量沒有土豆泥培養(yǎng)基多。香蕉泥有助于鐵皮石斛株高的生長以及根系的形成。蔣林等[14]、羅煥明等[15]都在研究添加物對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響中發(fā)現(xiàn)，香蕉有利于生根。土豆泥和香蕉泥中的青桿鐵皮石斛、紅桿鐵皮石斛出現(xiàn)紅色葉片，可能是內(nèi)生菌含量的增多，對植株產(chǎn)生脅迫作用，花青素含量增加。

（4）紅桿鐵皮石斛與青桿鐵皮石斛在生長上具有一定差異性。在組織培養(yǎng)的過程中，二者的表皮顏色并未出現(xiàn)明顯的區(qū)別。紅桿鐵皮石斛叢生芽增殖能力弱于青桿鐵皮石斛；株高上二者無較大差異，青桿鐵皮石斛的增殖能力又高于紅桿鐵皮石斛，推測紅桿鐵皮石斛在伸長生長上也略慢于青桿鐵皮石斛。在生根壯苗上，紅桿鐵皮石斛的根系長度和分蘗數(shù)都低于青桿鐵皮石斛，1 級根系數(shù)高于青桿鐵皮石斛。紅桿鐵皮石斛較青桿鐵皮石斛生物含量高，更具有藥用價值[5，16]。紅桿鐵皮石斛叢生芽增殖能力弱，伸長生長較慢都有利于有效物質(zhì)的積累。