大型真菌擔孢子形態觀察常用方法簡述

陳光富

（麗江師范高等專科學校應用技術學院，云南麗江674199）

大型真菌通常是指子實體較大、結構復雜的一類真菌，俗稱為傘菌、蘑菇或蕈菌等[1]，是菌物的重要組成類型。典型的傘菌子實體常由菌柄、菌環、菌褶或菌管、菌托、菌蓋、子實層、鱗片等部分組成。子實層是由擔子構成的可育層，菌褶或菌管是子實層的著生部位，多數傘菌子實層著生于菌蓋下方，擔子成熟后釋放出擔孢子[2]。大型真菌在地球環境保護和化學物質循環中起著重要作用，與森林植被形成共生關系，通過參與物質分解、富集重金屬等過程，發揮保護環境的作用。其次，大型真菌也可用于食用、藥用和觀賞等方面。在我國，真菌資源較為豐富，目前已有17 000 余種被發表報道[3]。在大型真菌分類鑒定中，擔孢子的形狀、顏色、大小、表面特征、孢子壁厚度等是分類鑒定的主要參考數值，擔孢子形態觀察是常用方法。目前，觀察擔孢子特征的方法主要有孢子印肉眼觀察、臨時裝片光學顯微觀察和電鏡標本掃描觀察。

1 孢子印肉眼觀察

1.1 試劑與器材

刀片或剪刀、不同顏色的薄紙片、培養皿、白乳膠或雞蛋清提取液、過塑機、硬卡紙、新鮮完好子實體、燒杯、清水。

1.2 制作方法[4-8]

選取不同對比色的薄紙片平鋪在實驗臺面上，將切除菌柄后的子實體（菌蓋）菌褶向下平鋪于紙片上，罩上培養皿，在室內靜置6～48 h，可根據不同傘菌種類或菌蓋大小適當設置靜置時間。設定時間到后，輕輕移去培養皿和菌蓋，可以看到在紙片上遺留有按菌褶呈放射狀排列的大量孢子，這就制成了孢子印或孢子堆。為使孢子印上的孢子干后不脫落，可以在紙上涂一層白乳膠或雞蛋清提取液，等晾干后進行簡易保存；如果要長期保存，則在晾干的孢子印后背墊上硬卡紙，過塑保存。

在制作過程中需根據孢子的顏色，選擇具有顏色反差的紙，比如孢子是白色則選擇黑色紙或半黑半白紙，其他顏色的孢子則選擇白色紙。如果要縮短孢子印的制作時間，在接取孢子的薄紙中央剪取適中的開口，將菌柄穿過開口浸入盛有適量清水的燒杯中，將菌蓋平鋪在薄紙上并在室內避風靜置，2～4 h后即可得到清晰的孢子印。

1.3 觀察內容

孢子印的制作原理是根據傘菌類擔孢子成熟時，在孢子和小梗連接處會分泌出布勒氏液滴，液滴在短時間內會膨大，在孢子彈射時由孢子攜帶離開小梗的原理制成的。擔孢子的數目很大，單一的孢子在顯微鏡下呈現出無色或有色，當大量孢子堆積在一起時能夠呈現出該菌類獨具的顏色，而呈現的這種顏色則是菌類分科分述檢索鑒定的重要特征之一。因此，制作的孢子印可直接用肉眼觀察顏色，根據孢子印的顏色常把傘菌分為粉紅孢子類、黃—褐孢子類、紫褐—黑色孢子類和白色孢子類等[3]。其次，可以用手指輕輕觸碰孢子粉末，能夠直觀感受到因孢子壁結構不同而產生光滑或晦澀的觸摸感[7]。

2 光學顯微鏡觀察

2.1 試劑與器材

顯微鏡、電腦（拍攝軟件）、載玻片、蓋玻片、中性紅染液、顯微鏡、浮載劑（5%～10%KOH）、剛果紅染液、單面刀片、鑷子、吸水紙、解剖針、蒸餾水、接種環等。

2.2 制作方法

孢子裝片觀察。先取載玻片置于實驗臺上，在載玻片中央位置滴1 滴中性紅，然后在孢子印上用接種環或解剖針沾取部分孢子粉或用接種環在菌蓋的菌褶兩側、子實層表面涂取孢子粉，將涂取的孢子粉輕置于試劑上，染色5～10 min，用鑷子將蓋玻片蓋上，鏡檢觀察，可以觀察到單個孢子形態。如果在孢子印或菌褶、子實層上涂取的孢子不理想，可以將子實體的菌柄切除，將菌蓋平鋪在培養皿內，24 h 后從培養皿中涂取孢子粉觀察[9]。

組織塊裝片觀察。取一片載玻片置于實驗臺上，在載玻片中央位置滴上1～2 滴5%～10% KOH 浮載劑。取新鮮子實體，用徒手切片的方法，用刀片沿菌蓋徑向切取較薄的組織塊，將組織塊置于浮載劑中浸泡1～5 min，并立即觀察成色反應。如果切取的是干標本或者是不同菌類標本可以適當延長復水時間，讓組織充分展開。浸泡過后用鑷子將蓋玻片蓋上，并在蓋玻片的一側滴上剛果紅試劑，在另一側用吸水紙吸引，使組織塊著色。或者在加蓋蓋玻片前在組織塊一側滴入剛果紅試劑，并且用解剖針和吸水紙吸引將組織塊染色體均勻后在加蓋蓋玻片。將制成的裝片在顯微鏡下鏡檢觀察[10]。

2.3 觀察內容

在光學顯微鏡下仔細觀察擔孢子的形狀、大小、顏色、孢子壁厚度、囊狀體的有無或形狀、內含物及成色反應等，或者測量擔孢子大小的正面觀和側面觀[10-11]，在觀察過程中需拍照記錄。

在記錄和測量過程中，一般測量孢子的長度和寬度。為使測量數據更精確，如果是在新鮮子實體上取的孢子印或組織塊，根據菌肉的薄厚隨機選取10～25 個成熟孢子進行觀察測量，如果在干標本上取的組織塊，根據孢子大小差異隨機選取20～50 個孢子進行測量；測量側面觀時，一般包括飾紋，附胞不計算。孢子大小范圍確定后，就可以計算出Q 值（孢子長寬比），根據Q 值說明孢子形狀[3，11]，目前常用的測量標準及劃分形態有7 種：①球形，Q=1.01～1.05；②近球形，Q=1.05～1.15，③寬橢圓形，Q=1.15～1.30；④橢圓形，Q=1.30～1.60；⑤長方形，Q=1.60～2.0；⑥圓柱形，Q=2.0～3.0；⑦桿狀，Q＞3.0。

3 掃描電鏡觀察

3.1 試劑與器材

掃描電鏡、單面刀片、樣品臺、硅片（銅片）、噴鍍機（濺射儀等）、無水乙醇。

3.2 制作方法

目前，電鏡標本制作常用方法是用刀片切取子實體菌蓋下菌褶或菌管的一片組織，將切取的組織放置于硅片上（銅片或者組織粘臺），用無水乙醇浸潤5～10 s 后取出自然干燥，約0.5～1 h 后，將樣品固定在樣品臺上進行真空鍍金[11]；或者不用浸潤直接將樣品固定在組織粘臺直接用離子濺射儀噴金，制成電鏡標本[12]。也有學者報道直接將濾取的孢子置于銅片或者膠面上，進行噴鍍后制成電鏡標本[13-15]。將電鏡標本制作好后，放在電鏡掃描儀下進行掃描觀察，并記錄。

3.3 觀察內容

電鏡技術的發展為孢子壁結構、孢子飾紋類型等特征的觀察提供了便利，為更好觀察孢子壁結構、孢子飾紋形態，在觀察過程中應盡量選擇成熟飽滿的擔孢子進行觀察記錄。在觀察測量過程中，一般包括長度、寬度、頂瘤、側瘤的大小等，并觀察孢子表面紋飾類型。孢子紋飾是孢子壁組織向外凸起生長產生的結構[3，11]。孢子紋飾有多個專業術語描述，有學者按凹型與凸型兩大類劃分為12 種形態描述：①穴紋：指孢子壁具圓形或近圓形的穴狀凹陷，口徑較大；②網紋：指孢子壁有角形凹陷；③齒狀網紋，指網紋網脊上有齒狀突起；④溝紋，指孢子壁上長條脊與深陷的長溝槽相間，不成網，條脊彼此多少平行或成角排列；⑤蠕蟲紋，指孢壁具短小而彎曲的條狀凸起，似蠕蟲；⑥顆粒狀紋，指圓顆粒狀突起，較細小，大小不等；⑦疣狀紋，指孢子壁具近半球狀突起，寬度大于高度，較顆粒紋大且較整齊；⑧瘤狀紋，指末端為鈍圓的瘤狀突起，高度大于或等于寬度；⑨棒狀紋，指孢子壁具棒狀突起，頂端圓頭鼓糙狀，高大于寬；⑩刺狀紋，指孢子壁末端一般為較尖的突起，基部較末端寬；11○塊狀紋，指孢子壁具不規則的塊狀突起，也可以是云塊狀；12○瓣狀紋，指孢子壁具翅棱狀突起[15]。

4 展望

在大型真菌種類鑒定中，隨著數值分類、化學分類、基因組學及分子生物學等技術的興起與推廣，菌物分類手段與技術越來越多元化。而利用傳統觀察孢子印和用顯微鏡技術對擔孢子形態特征進行觀察與測量的形態分類手段至今仍然被沿用[1，16，17]，因為這種方法直觀可靠，可比性較強，工作開展便利。特別是電子顯微鏡掃描鑒定技術可以清晰的觀測到擔孢子壁的表面特征、細胞內含物、孢子紋飾等，能更加精準有效的輔助分類鑒定。因此，擔孢子形態觀察方法將同菌物的外部形態鑒定、數值分類、化學分類和分子數據與序列對比等技術手段一樣成為菌類鑒定和多樣性遺傳研究的重要手段。