Aga0917-PGEX-4T-2-BL21(DE3)plySs表達條件優化

王燕 馬金 蘇曉滿 郝英慧

瓊脂是一類以半乳糖為主要成分的一種高分子多糖，瓊脂酶可將瓊膠水解，產生的低聚糖具有重要的生理學性質和生物學活性，益于人類健康。在相關分子生物學實驗當中，瓊脂酶也可以從瓊脂糖凝膠當中回收DNA、分離海藻中的原生質體和研究海藻細胞壁多糖結構和組成的工具酶。綜上，瓊膠酶具有十分廣闊的研究發展前景。本實驗主要探究Aga0917- PGEX- 4T- 2- BL21（DE3）plySs工程菌株發酵產酶的條件優化，以獲得大量有活性的重組酶。

實驗方法

生長曲線測定。挑取LB氨芐固體培養基上的Aga0917- PGEX- 4T- 2- BL21（DE3）plySs菌落，接種LB氨芐液體培養基，37℃、170rpm震蕩培養12h，作為種子液。將種子液，按1：100的比例接種LB氨芐液體培養基，37℃、170rpm震蕩培養，分別在培養0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h和13h時取出，以空白培養基為對照，測定600nm處的吸光值。每個時間點設置三個實驗組。以培養時間為橫坐標，以OD600為縱坐標，繪制基因工程菌株的生長曲線。

瓊膠酶酶活力測定。瓊脂的α- 1，3和β- 1，4糖苷鍵可以被瓊脂酶水解而產生還原性末端。在本實驗中，我們主要利用DNS法測定瓊膠酶活性，即D-半乳糖為標準，通過分光光度計測得的還原糖增量來定量瓊脂酶活力。向具塞試管中加入1ml 0.1%瓊脂糖底物酶，37℃水浴鍋預熱，再加入0.25ml粗酶液，37℃水浴30min，加入DNS 1.25ml，煮沸7min，取出冷卻后加入2.5ml蒸餾水，混勻。相同條件下，以空白培養基代替粗酶液組為空白對照，測定OD540值。酶活力（U/ml）定義為，反應條件下，每ml反應液每分鐘產生1μmol D-半乳糖所需酶量。

粗酶液制備。從固體培養基中刮取少量菌接種到加有Amp的種子液中震蕩培養12h。將種子液以1：100的比例接入發酵瓶中，37℃、170rpm震蕩培養2h，加入誘導劑IPTG，16℃、170rpm搖床中誘導培養16h。4℃、4000rpm離心10min收集菌體。加入5ml 20mM Tris- HCl（pH8.0）重懸。重懸完畢放于- 80℃冰箱冷凍30min。將解凍后的菌液進行細胞超聲破碎（180W，7min），于4℃離心機12000rpm離心30min。收集上清即為粗酶液。

IPTG濃度對菌株產酶酶活性的影響。誘導劑IPTG設置0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1 mM 七個濃度梯度。根據1.3部分的描述，制備粗酶液。根據1.2部分的描述測定各組的酶活力。

種齡的影響。種子液培養時間設置2h、3h、5h、7h、12h和24h 六個水平。根據1.3部分的描述，制備粗酶液。根據1.2部分的描述測定各組的酶活力。

誘導時機對酶活性的影響。加誘導劑前的培養時間設置2h、4h、6h、8h與10h 五個水平。根據1.3部分的描述，制備粗酶液。根據1.2部分的描述測定各組的酶活力。

誘導時間與溫度的影響。誘導時間設置8h、16h、24h和36h 四個水平，誘導溫度設置12℃、16℃、25℃和37℃四個水平。根據1.3部分的描述，制備粗酶液。根據1.2部分的描述測定各組的酶活力。

實驗結果與分析

生長曲線的測定

如圖1所示，在2h- 8h時間段為該菌株的對數生長期，8h之后進入穩定期。因檢測其吸光值只能檢測到菌體數量的多少，而分辨不出菌體的活性，故在穩定期過后仍然顯示吸光值增加，即在衰退期仍表現出吸光值的增加。在9、10h數值呈現下降趨勢，其原因可能是測量時誤差造成。

IPTG濃度對酶活性的影響

如圖2所示，經DNS法測得當濃度為0.01mol/L的IPTG時，OD540值最大，換算為相對酶活力，在該濃度下的酶活力最高。在誤差棒標注下，0.005mol/L的IPTG組存在誤差，其可能因為測量時為完全混合均勻，或在酶與底物反應時，實驗組加入酶的時間不同，導致酶與底物反應時間不同。

種齡對酶活性的影響

如圖3所示，種子液培養時間為2- 7h 間，酶活力隨種子液培養時間，有所上升，5h之后趨勢變緩，在7h處達到最大，相對酶活力顯示在12h- 24h處數值有下降趨勢。

誘導時機對酶活性的影響

如圖4所示，誘導前培養時間在2- 6h階段較為平穩且酶活最大，6h之后開始呈現下降趨勢。

誘導時間和溫度對酶活性的影響

如圖5所示，誘導時間為8h時，隨溫度的升高相對酶活緩緩上升，在25- 37℃之間酶活略有降低，但趨勢平緩；誘導時間為16h時，隨溫度的升高，相對酶活呈先下降后上升再下降的趨勢，12- 16℃下降趨勢平緩，16- 25℃上升明顯，且在25℃時相對酶活最高；誘導時間為24h時，整體呈緩緩下降的趨勢；誘導時間為36h時，在12- 25℃呈平緩趨勢，在25℃之后，呈較為明顯的下降趨勢。

誘導溫度為12℃時，培養16h酶活最好；誘導溫度為16℃時，培養16h酶活最高，8h次之；誘導溫度為25℃時，培養16h酶活最大，8h次之；誘導溫度為37℃時，培養時間為8h酶活最好。

綜上所述，當誘導培養時間確定時，選擇25℃培養最為適宜；當誘導培養溫度確定時且在25℃以下時，選擇誘導培養16h最為合適。當誘導培養溫度確定時且在25℃以上時，選擇誘導培養8h最合適。

基金項目：1.本研究由河南省科技計劃項目《碳水化合物結合結構域（CBM）對瓊膠酶Aga0917催化效率的影響》（編號：182102311134）

2.河南省教育廳《河南省高校省級大學生創新創業訓練計劃》（項目編號：201810472018）共同資助完成。

作者簡介：

王燕（1982-），女，漢族，山東聊城人，副教授，新鄉醫學院生命科學技術學院，博士，研究方向：微生物酶資源；馬金（1998-），女，漢族，河南南陽人，新鄉醫學院生命科學技術學院2017級本科在讀，研究方向：微生物；蘇曉滿（1999-），女，漢族，河南洛陽人，新鄉醫學院生命科學技術學院2017級本科在讀，研究方向：微生物酶資源；郝英慧（1999-），女，漢族，河南焦作人，新鄉醫學院生命科學技術學院2017級本科在讀，研究方向：微生物酶資源。