一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株的實(shí)驗(yàn)分析

研究背景概述

本文通過實(shí)驗(yàn)研制乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株，期望可以有效的治愈我國(guó)糖尿病患者。根據(jù)針對(duì)糖尿病中的免疫功能紊亂以及自由基毒素等致病因子對(duì)人體進(jìn)行作用，從而降低人體機(jī)能中的胰島素抵抗力以及胰島功能，最終形成蛋白質(zhì)、電解質(zhì)以及脂肪等系列性代謝紊亂癥狀的分析。提出了研制一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株的思路。

具體研究?jī)?nèi)容

pBpp蛋白概述。pBpp蛋白屬于一種功能性蛋白，可以用到人體的胰腺中，并且不必經(jīng)過糖代謝機(jī)制，可以促進(jìn)β細(xì)胞的增長(zhǎng)和繁殖，加快胰島素的分泌速度，而且對(duì)于人體的降糖操作刺激性不大，副作用也不大。

其次我們應(yīng)當(dāng)注意到的是，人體對(duì)pBpp蛋白的吸收率不高，口服形式的治療方法不予推薦。并且由于目前技術(shù)水平制約，pBpp蛋白的制備和生產(chǎn)無法達(dá)到量產(chǎn)的規(guī)模。因此應(yīng)用于實(shí)際的治療當(dāng)中還需要時(shí)日。

一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株的驗(yàn)證方法

依據(jù)乳酸乳球菌MG1363定植腸道的特性，在胃酸環(huán)境中能夠很好的實(shí)現(xiàn)乳酸乳球菌MG1363對(duì)pBpp蛋白的保護(hù)作用，并促進(jìn)重組蛋白集中分泌在腸道中，乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)，一方面實(shí)現(xiàn)了pBpp蛋白在人體內(nèi)部的正常表達(dá)，另一方面提高了人體對(duì)pBpp蛋白的吸收率。

第一步：以斑馬魚糞便菌群DNA為模板，依托于pMG36e質(zhì)粒，設(shè)計(jì)并運(yùn)用一對(duì)引物，進(jìn)行含有乳酸乳球菌分泌表達(dá)肽的pBpp蛋白表達(dá)基因的擴(kuò)展。

第二步：在大腸桿菌中進(jìn)行pMG36e質(zhì)粒的擴(kuò)增。

第三步：通過電轉(zhuǎn)手段，在pBpp重組蛋白中導(dǎo)入一種乳酸乳球菌MG1363。

第四步：取實(shí)驗(yàn)小白鼠，通過藥物針劑注射的方式，將50mg/kg計(jì)量的鏈脲佐菌素連續(xù)五天注射到小白鼠身上，使小白鼠患有糖尿病。并標(biāo)注為I型糖尿病模型小白鼠。

第五步：取一組制備好的乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)小白鼠，采取灌胃的形式，將乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株液體投放到小白鼠的體內(nèi)，進(jìn)行I型糖尿病模型小白鼠的病情治愈工作。

第六步：初期注意I型糖尿病模型小白鼠的給藥分量，控制在52CFU/天的分量左右，而且給藥的周期采取隔一天的形式進(jìn)行，即兩天給一次藥。

第七步：采取一周為一次的監(jiān)測(cè)周期，仔細(xì)觀察1型糖尿病模型小白鼠體內(nèi)的血糖數(shù)值變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)治療的過程當(dāng)中，1型糖尿病模型小白鼠體內(nèi)的血糖數(shù)值不僅得到了很好的控制，而且通過給藥行為，恢復(fù)了正常數(shù)值范圍，確定Ⅰ型糖尿病模型小白鼠被治愈成功。即說明一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株對(duì)于治愈糖尿病有一定的成效。

一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株的制備

第一步：進(jìn)行含有Usp45乳酸乳球菌分泌表達(dá)信號(hào)肽的pBpp蛋白表達(dá)基因的制備，仍然以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板。

第二步：將第一步制備的試驗(yàn)品連接到pMG36e載體上，獲得重組質(zhì)粒。

第三步：將第二步的重組質(zhì)粒投放到大腸桿菌中，獲得重組菌株。

第四步：制備感受態(tài)的乳酸乳球菌MG1363，選取凍存狀態(tài)下的乳酸乳球菌（MG1363），投放到MRS培養(yǎng)液基當(dāng)中，控制厭氧環(huán)境下的溫度，大約在三十?dāng)z氏度左右，上下浮動(dòng)不超過兩攝氏度。經(jīng)過大約十二小時(shí)的靜置培養(yǎng)以后，將培養(yǎng)基液中的菌液取出大約100pLus，將該液體均勻的涂抹在固體培養(yǎng)基平板上，保持相同的厭氧環(huán)境以及溫度范圍，經(jīng)過大約十二小時(shí)的靜置培養(yǎng)后，獲得單菌落。

第五步：將plMG36e- Usp45- pBpp（重組質(zhì)粒）從第三步的重組菌株中提取，使用電轉(zhuǎn)方法，并設(shè)置1.8kv的電壓，25uF的電容參數(shù)以及4.7ms的電轉(zhuǎn)速度，將重組質(zhì)粒投放到感受態(tài)的乳酸乳球菌中，在感受態(tài)的狀態(tài)下，實(shí)現(xiàn)兩者在電轉(zhuǎn)杯中混合。

第六步：采取紅莓素抗性篩選方法，獲得一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株。

綜上所述，一種乳酸乳球菌MG1363介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株對(duì)于治愈糖尿病有一定的成效。

作者簡(jiǎn)介：

崔國(guó)賢（1987-），女，內(nèi)蒙古通遼人，初級(jí)，大專，研究方向：微生物檢測(cè)。