犬小孢子菌PQ-LRP蛋白的定位研究

劉洋 徐宇 張芙蓉 譚燦 楊國玲

大連醫科大學附屬第一醫院皮膚科 116011

犬小孢子菌可引起人畜共患的皮膚癬菌病，是我國兒童頭癬的常見病原菌。本課題組前期已通過抑制消減雜交技術（SSH）成功構建犬小孢子菌差異基因文庫［1］，篩選出頭皮誘導培養下呈差異表達的4條基因，其中PQ-LRP基因在頭皮誘導培養下較光滑皮膚呈現高表達［2］。我們通過cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術完成PQ-LRP基因全長cDNA序列的擴增和測序［3］，利用RNA干擾技術構建犬小孢子菌PQ-LRP干擾株［4］，發現PQ-LRP基因干擾株較野生株生長受限，不易感染宿主，毒力減弱，推測PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌致病毒力因子之一［5］。為研究PQ-LRP在犬小孢子菌中的定位，我們將PQ-LRP基因片段連接至增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的上游后在犬小孢子菌中表達，并對融合EGFP在細胞中的定位進行初步研究，為后期探討該基因在頭癬發病機制中的作用提供理論基礎。

材料與方法

一、材料

犬小孢子菌標準株（ACTT10394）為大連醫科大學附屬第一醫院皮膚科真菌室保存菌種，經傳統培養及轉錄間隔區序列PCR擴增后電泳鑒定為犬小孢子菌。TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、TaKaRa Tks Gflex DNA聚合酶、TaKaRa MiniBEST瓊脂糖DNA提取試劑盒均為日本TaKaRa公司產品；根癌農桿菌EHA105電轉感受態細胞、Premix TaqTM、大腸桿菌JM109感受態細胞、Tks Gflex?DNA聚合酶、In-Fusion?HD Cloning試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產品；潮霉素產自Sigma-Aldrich（中國）公司；Trizol試劑盒為賽默飛世爾（中國）科技有限公司產品；質粒pEGFP-N1、pSilent-1、pCAMBIA1300為武漢淼靈科技有限公司產品。

二、方法

1.犬小孢子菌總RNA提取：參照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用紫外分光光度計測定A260/A280比值，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA片段大小。

2.融合基因表達載體的構建及根癌農桿菌轉化：①將自犬小孢子菌中提取的總RNA反轉錄為cDNA；②以上述cDNA為模板，引物見表1，PCR擴增PQ-LRP基因，兩端添加酶切位點SacⅠ/BamHⅠ，反應條件：94℃預變性1 min，98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸60 s，共35個循環；③將pEGFPN1質粒用SacⅠ/BamHⅠ雙酶切（37℃2 h），將酶切后純化回收的pEGFP-N1載體與PQ-LRP基因片段連接（50℃15 min）得到pEGFP-LRP載體，將連接產物轉化到大腸桿菌（E.coli）JM109中，提取質粒測序驗證；④以pSilent-1質粒為模板，PCR擴增真菌通用啟動子（Ptrpc）和真菌通用終止子（Ttrpc）序列，引物見表1；以pEGFP-LRP載體為模板，PCR擴增LRP-EGFP基因序列，擴增引物見表1，反應條件：98℃變性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸45 s，共30個循環；⑤SacⅠ/HimdⅢ雙酶切pCAMBIA 1300質粒（37℃4 h），將酶切后純化回收的pCAMBIA 1300載體與上述④中PCR擴增產物連接（50℃15 min），得到表達載體。將上述重組的表達載體pCAMBIA-LRP-EGFP轉化到E.coliJM109中，挑取單菌落，提取質粒送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序驗證。用電轉化方法將表達載體從E.coliJM109供體菌中轉入根癌農桿菌EHA 105中，對陽性克隆用M13-47、RV-M引物（表1）進行PCR鑒定。

表1 構建pCAMBIA-LRP-EGFP表達載體所用引物

3.犬小孢子菌轉化及轉化子篩選：取1 ml吸光度A600為0.6～0.8的轉化后根癌農桿菌與1 ml 5×105個/ml的犬小孢子菌分段菌絲混合，將200 μl混合液涂布于添加乙酰丁香酮（AS 200 μmol/L）的誘導平板上，25℃避光培養24、36、48、60、72 h，將共培養的含有根癌農桿菌和犬小孢子菌分段菌絲的混合物轉移到誘導平板上（含300 mg/L潮霉素、200 μmol/L頭孢噻肟鈉），25℃培養14 d直至菌落出現［4，6］。將犬小孢子菌轉化子在無潮霉素的沙氏培養基上傳代5次后，接種至含有潮霉素（300 mg/L）和頭孢噻肟鈉（200 μmol/L）的誘導平板上，檢測轉化子的遺傳穩定性，提取上述轉化子基因組DNA，PCR擴增融合基因LRP-EGFP進行驗證。

4.菌絲處理及LRP-EGFP融合蛋白定位：將帶有融合質粒的犬小孢子菌轉化子在沙氏培養基上培養14 d后，取菌絲用PBS（pH7.4）沖洗2次，用0.5 mol/L山梨醇溶液處理后置于載玻片上用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

結果

一、融合基因表達載體的鑒定

1.pEGFP-LRP質粒PCR鑒定：用引物LRP-EGFP-F、LRP-EGFP-R進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見約1 800 bp的目的片段，證明目的片段連接到pEGFP-N1載體中，得到載體pEGFP-LRP（圖1），經測序驗證為目標序列。

2.Ttrpc、Ptrpc的PCR擴增：對Ptrpc與Ttrpc基因片段的擴增產物進行電泳，分別可見約1 300 bp與780 bp左右的片段，與Ptrpc及Ttrpc基因片段相符。見圖1。

3.表達載體pCAMBIA-LRP-EGFP測序驗證：驗證結果顯示，PQ-LRP與EGFP基因片段蛋白質編碼區（CDS）區無突變。

二、pCAMBIA-LRP-EGFP質粒的根癌農桿菌轉化結果

將pCAMBIA-LRP-EGFP質粒電轉化到根癌農桿菌EHA105中，PCR鑒定顯示約4 000 pb的片段（圖2），證明載體轉入根癌農桿菌中。

三、犬小孢子菌轉化子驗證

圖1 LRP-EGFP、Ttrpc、Ptrpc基因片段PCR擴增產物M：標準參照物；1：Ptrpc（1 340 bp）；2：LRP-EGFP（1 838 bp）；3：Ttrpc（786 bp）圖2轉染pCAMBIA-LRP-EGFP質粒的根癌農桿菌M：DNA標準參照物；1：pCAMBIA-LRP-EGFP質粒

圖3 犬小孢子菌轉化子DNA電泳圖M：標準參照物；1：犬小孢子菌轉化子基因組DNA圖4犬小孢子菌轉化子融合基因LRP-EGFP的PCR檢測M：標準參照物；1：轉化子LRP-EGFP

瓊脂糖凝膠電泳顯示，犬小孢子菌轉化子基因組DNA條帶比較透明清晰，無拖帶現象（圖3），紫外分光光度計檢測顯示，濃度和純度均達到要求，可以滿足后續PCR檢測。PCR擴增LRP-EGFP后瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示約1 800 bp的目的片段，證明外源基因已整合到犬小孢子菌基因組DNA中，見圖4。

四、LRP-EGFP融合蛋白的細胞定位分析

共聚焦顯微鏡下可觀察到極強的綠色熒光信號，LRP-EGFP的熒光信號呈顆粒狀或團塊狀集中于收縮的犬小孢子菌細胞的細胞膜上，見圖5。

討論

目前，已有多種多樣的技術手段運用于探索蛋白質的亞細胞定位，如亞細胞定位預測、特異性抗體免疫組化定位、融合報告基因定位等，其中融合報告基因定位法因具有簡單有效、準確率高、可以活體樣本實時監測的優點在分子生物學研究領域應用廣泛，其原理是將目的蛋白基因與標記蛋白基因拼接融合共表達，通過檢測標記蛋白研究目標蛋白，最常見的報告分子為GFP，是一種由239個氨基酸組成的單體蛋白［7］，其熒光反應不需要任何底物及輔助因子，熒光穩定，且其分子量相對較小，與其他蛋白融合后不影響自身的發光功能。本研究所用EGFP是將GFP的Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使熒光強度提高35倍，而且激發后16～24 h仍可穩定地檢測到熒光［8］。我們成功構建了pCAMBIA-LRP-EGFP表達載體，利用根癌農桿菌轉化將融合基因整合到犬小孢子菌基因組DNA，實現了Ptrpc和Ttrpc調控下LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中的表達。將轉化后犬小孢子菌菌絲用0.5 mol/L山梨醇處理使其脫水，細胞膜與細胞壁分離后發現LRP-EGFP的熒光信號集中于收縮細胞的細胞膜上，而在細胞壁未見明顯熒光信號，說明PQ-LRP蛋白定位于細胞膜。

PQ-LRP基因全長1 522 bp，含有一個1 080 bp的開放閱讀框（翻譯359個氨基酸）以及5′端非編碼區（49 bp）和3′端非編碼區（393 bp）。為使融合EGFP能準確報告PQ-LRP基因在犬小孢子菌中的定位，避免遺漏可能存在的定位信號，且不影響EGFP蛋白折疊，我們利用SacⅠ與BamHⅠ酶切位點將PQ-LRP基因片段連接至EGFP的C端（上游），使PQ-LRP基因片段的插入對EGFP的表達無影響，測序結果證實PQ-LRP與EGFP閱讀框均無突變。

圖5 激光共聚焦顯微鏡分析LRP-EGFP重組蛋白在犬小孢子菌細胞中的定位

PQ-LRP蛋白是一種雙環狀結構的膜綁定蛋白，在真菌中普遍存在且與真菌的生長生存有密切聯系［9］。本研究組前期發現，犬小孢子菌PQ-LRP基因干擾株大分生孢子大小不一，形狀不規則，孢子壁皺褶破裂，分隔減少或缺如，細胞內容物不均勻，出現空泡甚至缺失，推測犬小孢子菌的細胞膜和細胞壁與PQ-LRP基因有密切聯系，當外源性加入半胱氨酸時，野生株PQ-LRP基因表達水平隨半胱氨酸濃度的增加呈上升趨勢［5］，Xiao等［10］上調PQ-LRP基因表達量后發現半胱氨酸代謝水平隨之提高，PQ-LRP可能通過影響半胱氨酸的合成代謝影響細胞壁主要成分幾丁質的合成，使犬小孢子菌細胞壁結構受到破壞。我們猜測PQ-LRP蛋白不僅參與細胞膜和細胞壁成分的合成代謝，并且是犬小孢子菌細胞膜的重要組成部分。

本實驗中，我們對犬小孢子菌PQ-LRP蛋白的亞細胞定位進行初探，建立了一種適用于犬小孢子菌蛋白的GFP標記方法，無論是對犬小孢子菌其他蛋白質亞細胞定位的研究，還是對進一步探索PQLRP蛋白的結構及與其他蛋白質的相互作用機制等，均提供了理論依據。