申克孢子絲菌酵母相形成過程中轉錄組表達譜變化及差異表達基因功能分析

韓昌旭 侯彬彬 晉亮 張振穎

1香港大學深圳醫院皮膚科 518000；2大連醫科大學附屬第二醫院皮膚科 116000；3空軍特色醫學中心皮膚科，北京 100142

孢子絲菌病是由申克孢子絲菌及其復合體引起的皮膚、皮下組織及附近淋巴管的慢性感染性疾病，是最常見的皮膚深部真菌病。孢子絲菌屬于雙相性病原真菌，自然環境中呈腐生狀態生長，無致病性，入侵宿主后其生存環境發生驟變，菌體為適應變化的環境發生形態轉換，呈寄生狀態生長并致病［1］。深入探究孢子絲菌感染宿主的過程對選擇新的藥物作用靶點和研發新的抗真菌藥物至關重要。轉錄組學是研究特定的細胞或組織在特定的功能狀態下基因組產生的全部轉錄物的種類、結構和功能，可以揭示生物學進程或疾病發生的分子機制。探究孢子絲菌致病的酵母相形成過程中轉錄組學的變化將有助于闡明孢子絲菌致病性形成的分子機制，開發新的抗真菌藥物作用靶位。本研究通過RNA-seq高通量測序方法，對孢子絲菌菌絲及酵母相細胞的兩個逆轉錄文庫進行測序分析，組裝獲得篩選后的單基因簇（unigene），再基于基因在不同樣品中的表達量識別差異表達基因，對其進行模式聚類、功能注釋以及富集性分析來進行功能預測。

材料與方法

一、申克孢子絲菌菌株及培養

申克孢子絲菌標準菌株ATCC10268為大連醫科大學真菌中心保存菌株，用沙氏液體培養基（SDA）在25℃振蕩（100 r/min）培養96 h獲得菌絲相菌體，轉種于腦心浸液（BHI）液體培養基，37℃振蕩（100 r/min）培養36 h獲得酵母相菌體。4℃下3 000×g離心5 min，棄上清液收集菌體，部分用于制片、鏡檢，其他在-80℃凍存備用。

二、總RNA提取

分別取孢子絲菌菌絲相和酵母相200 mg，液氮研磨，采用植物總RNA提取試劑盒（美國Promega公司），按照說明書提取總RNA。紫外分光光度計測定吸光度A260和A280，計算RNA純度和濃度。

三、mRNA富集純化

以帶有Oligo（dT）的磁珠（美國Thermo Fisher科技公司）富集真核生物mRNA，按照mRNA純化試劑盒的操作說明書進行，使用生物素-磁珠法從總RNA中富集純化mRNA，紫外分光光度計測定A260和A280，計算RNA純度和濃度。

四、鏈特異性文庫構建

加入碎片化緩沖液將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶I和RNase H合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP磁珠純化雙鏈cDNA。對純化的雙鏈cDNA先進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇。之后用USER酶降解含有堿基U的cDNA第二鏈，使最終的測序信息都來自于第一鏈cDNA，從而保留mRNA的鏈方向性。最后進行PCR（美國Bio-Rad生命醫學產品有限公司）擴增，并用AMPure XP beads純化PCR產物，得到鏈特異性cDNA文庫。

使用Qubit3.0進行初步定量，稀釋文庫至1mg/L，隨后使用Agilent 2100檢測文庫插入片段的大小，符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求分組后進行HiSeq測序。共取3個樣本，每個樣本選取3個生物學重復的RNA樣品混合后進行RNA-Seq轉錄組測序，取所有樣本檢測的平均值。

五、數據分析

將下機數據進行過濾得到有效數據（clean reads），將短reads進行拼接組裝獲取較長的unigene序列集。將clean reads與組裝獲取的unigene序列進行比對，得到Mapped Data，進行插入片段長度檢驗、隨機性檢驗等文庫質量評估；根據基因在不同樣品或不同樣品組中的表達量進行差異表達分析，對篩選后的基因（unigene）進行功能注釋，包括與數據庫（NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO、Pfam）的比對，同時還進行編碼區序列（CDS）預測及基因在每個樣品中的表達量分析。最后，應用功能軟件對差異表達基因進行模式聚類、功能注釋以及富集性分析。

結果

一、測序質量評估

1.測序reads評估：評估顯示原始序列中含有帶接頭的、低質量的reads。菌絲相菌體clean reads達到97.72%，酵母相菌體達到97.88%（圖1），獲得14.76 Gb有效數據（clean Data），各樣品有效數據均達到7.36 Gb，Q30堿基占比（堿基質量值≥30）≥94.85%，即14.76 Gb的有效數據中94.85%的堿基正確率為99.9%。將各樣品的clean reads進行組裝，獲得43 863條unigene，其中17 667條長度在1 kb以上。基于unigene庫進行基因結構分析，共獲得11 783條簡單重復序列標記。

圖1 申克孢子絲菌測序reads評估1A：菌絲相菌株；1B：酵母相菌株

2.測序飽和度分析：使用各樣品的Mapped Reads對檢測到的基因數目的飽和情況進行模擬，繪制曲線圖（圖2），各曲線越往右延伸，斜率越小，逐漸趨于平坦，提示各樣品隨著測序數據量的增加，新檢測到的基因越來越少，趨于飽和，有效測序數據量充足。

3.測序隨機性評價：本研究中轉錄組建庫為鏈特異性建庫，出現了GC分離的現象，且整個測序過程基本穩定不變，呈水平線。見圖3。

4.比對分析：將各樣品的有效數據與組裝得到的轉錄子或unigene庫進行序列比對，菌絲相與早期酵母相的clean reads分別為49 086 618、49 322 654，mapped reads（比對到Transcript或unigene的Reads）分別為46 356 350、46 833 812，匹配率分別為94.44%、94.95%。將Mapped Reads用于后續的分析。

二、差異表達基因分析

1.酵母相差異表達基因數量分析：以差異倍數≥2或≤1/2且錯誤率＜0.01作為標準篩選差異表達基因。與菌絲相相比，酵母相10 969條基因表達上調，199條下調，29 163條未見改變。見圖4。

圖2 轉錄組測序數據飽和度模擬圖

圖3 申克孢子絲菌菌絲相（3A）和酵母相（3B）菌體堿基含量分布圖

2.差異表達基因的GO功能注釋：差異基因GO富集柱狀圖顯示，差異基因主要參與信號傳導、細胞組分生物代謝等過程。挑選富集最顯著的30條GO詞條，其中29條與生物過程相關，1條與分子功能相關，見圖5。

3.差異表達基因的通路分析：對差異表達基因KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分類，結果顯示，差異表達基因參與蛋白磷酸化、細胞內蛋白轉運、細胞蛋白修飾、小GTP酶介導的信號轉導、囊泡介導轉運、翻譯、細胞內信號轉導、微管形成、ATP合成偶聯質子轉運等過程（圖6）。參與真菌形態形成的兩個重要信號轉導通路MAPK及雙組分信號通路中的16條基因和參與幾丁質合成代謝的16條基因均被證實在早期酵母相上調表達。表1列舉了在酵母相中表達上調的3條參與MAPK信號轉導通路的基因、3條雙組分信號傳導通路的基因和4條幾丁質合成代謝的基因。

討論

對孢子絲菌雙相轉換過程進行深入研究不僅有助于深刻理解孢子絲菌病的發病機制，還有助于研發新型的抗真菌藥物。迄今，孢子絲菌的基因組序列尚未被完全公布及注釋，轉錄組學研究可作為基因組學研究的一種有利補充。

在溫度誘導下由菌絲相向酵母相發生形態轉換的過程被認為是孢子絲菌毒力基因表達及致病性形成的過程［2］。雖然Pho85［3］、蛋白激酶C［4］、腦苷脂［5］被認為是與孢子絲菌形態轉換有關的毒力分子，但啟動其雙相轉換的具體機制尚不明確。我們先前研究證實，菌絲相孢子絲菌在BHI液體培養基培養36 h即出現酵母相的部分形態特征［6］，故本研究中我們比較菌絲相和早期酵母相轉錄組圖譜的差異，以期明確孢子絲菌雙相轉換過程的啟動機制。

本研究表明，與菌絲相比較，酵母相上調表達的基因多達10 969條，下調表達的基因僅為199條。進一步對差異基因進行模式聚類、功能注釋以及富集性分析，表明上述基因參與蛋白磷酸化、細胞內蛋白轉運、細胞蛋白修飾、小GTP酶介導的信號轉導、囊泡介導轉運、翻譯、細胞內信號轉導、微管形成、ATP合成偶聯質子轉運等諸多過程，提示孢子絲菌形態轉換過程涉及的機制十分復雜。

圖4 酵母相和菌絲相申克孢子絲基因差異表達圖FPKM：fragments per kilobase of exon per million reads mapped，每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的片段

圖5 酵母相和菌絲相申克孢子絲菌差異表達基因GO富集柱狀圖

圖6 酵母相和菌絲相申克孢子絲菌差異表達基因KEGG分類圖

表1 申克孢子絲菌酵母相較菌絲相表達上調的部分基因的功能注釋

值得關注的是參與真菌形態形成的兩個重要信號轉導通路MAPK及雙組分信號通路中的16條基因也被證實在早期酵母相上調表達。MAPK通路在病原真菌中具有重要調控功能，參與細胞壁的完整性通路、孢子壁的完整性通路、孢子壁的組裝通路、菌絲的生長通路、信息素的反應通路、高滲透性甘油通路的信號調控，進而調控病原真菌的生長、繁殖、應激及形態形成［7］。MAPK通路受控于其上游信號傳導通路——雙組分信號通路，而后者在病原真菌中具有廣泛的調節作用，包括細胞壁的生物合成、毒力基因的表達、耐藥性、形態形成等［8-10］。我們既往研究發現，孢子絲菌雙組分信號系統組氨酸蛋白激酶DRK1和MAPK通路中絲氨酸蛋白激酶Ste20的蛋白水平在酵母相早期上調，DRK1/Ste20基因表達被干擾后，其向酵母相形態轉化受阻，菌株毒力減弱，提示二者在孢子絲菌形態轉化及致病性形成過程中起重要作用［11］。本研究中我們在酵母相中鑒定出上調表達的9條MAPK通路基因和7條雙組分信號通路基因，推測雙組分信號通路、MAPK信號傳導通路參與孢子絲菌對外界環境因素的感知、菌絲相向酵母相的形態轉化及菌體致病性形成的過程。

幾丁質又稱甲殼素，是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子生物多聚體，既是真菌細胞壁的重要組成部分，也是其重要毒力因子［12］。細胞壁是真菌抵御滲透壓和外界機械損傷的重要屏障，幾丁質富集是真菌細胞抵抗或適應惡劣的外部環境的主要手段，而幾丁質暴露會造成分生孢子的毒力減弱，有利于誘發抗真菌免疫應答，減輕組織炎癥損傷［13］。幾丁質合成酶是控制幾丁質合成的關鍵酶。本研究鑒定出包括幾丁質合成酶及內切幾丁質酶在內的16條基因在酵母相上調表達，提示孢子絲菌菌絲相向酵母相轉換的早期幾丁質合成代謝發生改變，可能參與孢子絲菌酵母相的形態形成及致病性產生。

綜上，我們應用RNA-seq高通量測序方法對早期酵母相及菌絲相申克孢子絲菌的轉錄組學進行比較，差異表達基因的鑒定與功能注釋有助于我們對孢子絲菌致病性形成的分子機制有更深刻的認識，也為孢子絲菌病治療藥物的研發提供新的思路，如脊椎動物體內不存在雙組分信號蛋白及幾丁質成分，故二者均可作為理想的藥物作用靶點。將來我們擬通過基因敲除或干擾技術構建基因缺陷株，對重要差異基因做進一步的功能研究。