Ki67、MCM2、ERCC1和FLI-1在惡性腹膜間皮瘤中的表達及其與預后的關系*

梁育飛，鄭國啟△，李春英，孫寧寧，郭忠建

(滄州市中心醫院：1.消化內科；2.病理科，河北滄州 061001)

惡性腹膜間皮瘤(malignant peritoneal mesothelioma，MPeM)是發生于腹膜間皮組織的惡性腫瘤，發病率低，易被漏診或誤診[1]。該病以40～70歲多見，男女比例約2∶1，臨床表現缺乏特異性。組織病理學及免疫組織化學染色在間皮瘤的診斷中占有重要地位[2]，該病病死率高，預后差。因此，尋找預后影響因素已成為目前研究的熱點。Ki67、微型染色體維持蛋白2(minichromosome maintenance protein 2，MCM2)、核苷酸切除修復交叉互補因子-1(excision repair cross complementing group 1,ERCC1)、FLI-1、血管內皮生長因子受體-3(vascularendothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3)、程序性死亡受體-配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)和絨毛蛋白Villin通過促進細胞分化增殖及抑制細胞凋亡等不同途徑在腫瘤細胞的發生、發展、侵襲及轉移等過程中發揮著重要作用。本研究應用免疫組織化學SP法檢測以上7種標記物在MPeM組織中的表達，分析其與臨床病理特征的關系，探討這些標記物與臨床病理因素對預后判斷的價值，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 經本院醫學倫理委員會批準(倫理號：2012-012-01)，收集2013年1月至2016年12月在本院經B型超聲引導下穿刺活檢或手術獲取的14例患者非上皮型MPeM組織石蠟標本，并收集同期30例患者上皮型MPeM組織石蠟標本。所有患者均為初診病例并且資料完整。標本切片均經兩名有經驗的病理科醫師閱片后確診，MPeM病理診斷符合2012年美國《間皮瘤病理學診斷指南》[2]。患者年齡42～84歲，平均(62.86±10.89)歲，男15例、女29例。臨床TNM分期[3]：Ⅰ期，腫瘤局限于腹膜；Ⅱ期，腫瘤侵犯腹腔內淋巴結；Ⅲ期，腫瘤向腹腔外淋巴結轉移；Ⅳ期，遠處血行轉移。Ⅰ+Ⅱ期患者34例，Ⅲ+Ⅳ期患者10例。

1.2主要試劑 鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號：MIB-1)，兔抗人微小染色體維持蛋白2克隆抗體(克隆號：EP-40)，鼠抗人ERCC1單克隆抗體(克隆號：UMAB8)，鼠抗人FLI-1單克隆抗體(克隆號：MRQ-1)，鼠抗人血管內皮生長因子受體-3單克隆抗體(克隆號：KLT9)，鼠抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號：UMAB-228)，鼠抗人Villin單克隆抗體(克隆號：OTI3B3)，均購自中國北京中杉生物技術有限公司，嚴格按照說明書操作。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學檢測及判定標準 全部腹膜組織標本在同一條件下采用免疫組織化學染色SP法。經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，加入一抗，經孵育過夜后，滴加生物素標記二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素對比復染，常規脫水、透明、干燥、中性樹膠封片。每張切片隨機取3個高倍視野，以陽性細胞比例的平均值定義為該腫瘤的陽性細胞百分比。Ki67陽性細胞多數為核著色，呈棕黃色，少數為較弱的細胞質染色；MCM2、ERCC1和FLI-1陽性表達主要定位于細胞核，表現為細胞核內有棕黃色到深褐色顆粒；VEGFR-3陽性表達主要定位于細胞膜或細胞質，呈棕黃色至棕褐色顆粒；PD-L1和Villin均以細胞質呈棕黃色至棕褐色為陽性。陽性染色細胞百分比小于5%，判為“-”；5%～<26%判為“+”；26%～50%判為“++”，>50%判為“+++”。

1.3.2隨訪 生存期以病理診斷證實為MPeM的日期為起點，隨訪至2017年6月，以月為單位，至隨訪終點仍生存作為截尾值處理。全組無失訪病例。

1.4統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行統計分析。計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法。相關性分析采用Spearman等級分析。單因素生存分析比較采用Kaplan-Meier法，時序檢驗(Log-rank法)比較其差異，多因素生存分析采用Cox比例風險模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1標記物在MPeM組織中的表達 在44例MPeM中，MCM2陽性率最高，為100.0%；其次為FLI-1，陽性表達者42例，陽性率為95.4%；ERCC1陽性表達者31例，陽性率為70.4%；Ki67陽性表達者21例，陽性率為47.7%；VEGFR-3、Villin、PD-L1的陽性率分別為18.2%、15.9%、6.8%。見圖1。

表1 MPeM各標記物與臨床病理學的關系(n)

續表1 MPeM各標記物與臨床病理學的關系(n)

A:Ki67；B:ERCC1；C:FLI-1；D:MCM2；E:VEGFR-3；F:PD-L1；G:Villin

圖1 7種標記物在MPeM的表達(SP，×400)

2.2標記物與臨床病理學的關系 44例MPeM中，6項標記物(Ki67、ERCC1、FLI-1、VEGFR-3、PD-L1和Villin)與臨床病理因素的關系見表1。經統計分析，各指標組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3各標記物表達間的相關性 在44例MPeM中，FLI-1和ERCC1的表達呈正相關(r=0.337，P=0.025)；FLI-1和PD-L1(r=-0.374，P=0.012)、ERCC1和PD-L1(r=-0.418，P=0.005)的表達均呈負相關。其余標記物相互間均無相關性。

2.4影響MPeM患者預后的單因素及多因素分析 本組44例患者隨訪資料完整，無失訪病例。最后隨訪時間為2017年6月。隨訪期間，40例患者死于疾病復發。1年總生存率為19.9%，2年總生存率為4.4%，中位生存時間為7個月，見圖2。將患者性別、年齡(60歲)、石棉、血小板、TNM分期、淋巴結轉移、腹水、胸膜斑、組織學類型、化療及7項標記物進行單因素分析，顯示化療(P=0.027)、TNM分期(P=0.006)、ERCC1(P=0.027)及Ki67標記指數大于或等于20%(P=0.030)是與預后有關的因素，而其余指標均與預后無關(P>0.05)。見圖3、表2。

圖2 44例MPeM患者的總生存曲線

2.5影響MPeM患者預后的多因素分析 將單因素分析有意義的4項指標納入COX比例風險模型進行多因素分析，結果顯示，TNM分期(P=0.031)及Ki67標記指數大于或等于20%(P=0.036)是影響MPeM預后的獨立危險因素，見表3。

表2 MPeM預后相關因素的單因素分析

A：ERCC1與MPeM生存時間的關系；Ki67與MPeM生存時間的關系；TNM分期與MPeM生存時間的關系；化療與MPeM生存時間的關系

圖3 ERCC1、Ki67、TNM分期、化療與MPeM生存時間的關系

表3 MPeM預后相關因素的多因素分析

3 討 論

MPeM是一種腹膜少見疾病，臨床缺乏特異性，確診需靠腹膜活組織病理學檢查，免疫組織化學染色對于診斷具有重要意義。針對其機制及預后的研究已成為目前關注的熱點，不同學者對于MPeM預后的因素分析有不同結論。YAN等[4]報道，組織分型、無淋巴結轉移、手術及腹腔內熱灌注化療(HIPEC)是獨立的預后影響因素。DAMHUIS等[5]報道，年齡及性別是獨立的預后影響因素。免疫組織化學指標對預后的影響如何，文獻較少報道。因此，本研究聯合臨床病理學指標及Ki67、ERCC1、Fli-1等免疫組織化學指標進行預后分析，以期得出影響MPeM預后的危險因素。

腫瘤的發生、發展和轉移是多步驟、多因素、多階段和多基因改變的復雜過程，有多重因子參與其中。Ki67抗原是目前較為肯定的核增殖標志物，是檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一，與多種腫瘤的預后有關[6-7]。Ki-67在MPeM組織中表達的報道較少，主要與MPeM相對少見有關。PILLAI等[8]研究了42例MPeM腫瘤中Ki67的表達，結果提示Ki67抗原的高表達與不良生存相關。本研究中，Ki67陽性表達率為47.7%，單因素和多因素檢測Ki67標記指數大于或等于20%與預后有關，且是預后的獨立危險因素。這提示腫瘤分化越差，增殖活性越強，惡性程度越高。根據腫瘤大小、淋巴結轉移及遠處轉移所制訂的TNM分期能夠較好地反映腫瘤的發展程度，同時對于預后有一定參考價值[9]。本研究中，Ⅰ+Ⅱ期患者生存期明顯較Ⅲ+Ⅳ期患者長，也是預后的獨立危險因素，提示腫瘤分期越早，治療越早，對于疾病轉歸越有利。

ERCC1不僅是核苷酸切除修復(NER)活性的標志性基因，也是細胞存活必需的DNA修復基因。在腫瘤組織中，ERCC1通過對放射線或者化療藥物的DNA損傷修復導致治療失敗。目前研究較多的是胃癌、大腸癌[10]、肺癌等。MATSUBARA等[11]認為，ERCC1是進展期胃癌預后評估的有效指標。另有研究報道，ERCC1陰性表達的患者有很好的化療反應性，是評價患者預后的一個重要因子[12]。本研究結果顯示，ERCC1的陽性表達率達70.4%，生存分析顯示ERCC1與預后有關，但并不是獨立危險因素，提示ERCC1表達強度越強，患者生存時間越短，與上述研究相符。FLI-1基因是人類ETS基因家族中的一員，參與DNA轉錄、細胞增殖和腫瘤發生。MHAWECH-FAUCEGLIA等[13]發現，尤文肉瘤/原發性神經外胚層腫瘤(EWS/PNET)、嗅神經母細胞瘤、小細胞肺癌、橫紋肌肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、良惡性血管瘤、鱗狀細胞癌、腺癌組織中均可檢測到不同程度的FLI-1表達。KAYGUSUZ等[14]對52例患者胃腸道間質瘤組織進行檢測，卻未發現FLI-1表達，提示其不參與胃腸道間質瘤的形成。本研究中，FLI-1的陽性表達率高達95.4%，提示腹膜間皮瘤與胃腸道間質瘤的發病機制存在明顯差別，可以用來作為診斷腹膜間皮瘤的參考指標。

MCM2只存在于細胞周期的細胞核中，在增殖細胞中表達水平高，在靜止期細胞或分化好的細胞中不表達或水平很低，提示MCM2可以作為增殖細胞的特異標志。有研究顯示，在胃癌組織中MCM2的表達明顯高于正常黏膜組，且MCM2的表達水平與預后呈正相關[15]。本研究結果顯示，MCM2在MPeM中的表達率為100.0%，提示MCM2與腹膜間皮瘤病理類型無關，也提示檢測MCM2對于診斷MPeM具有很高的參考價值。但在生存分析中，MCM2不是影響預后的因素，這可能與MPeM的發病機制有關，是否與病例數相對不足有關尚不清楚，需進一步積累資料證實。

Villin通常只表達于有刷狀緣的細胞上，如胃腸道上皮細胞、胰腺和膽管上皮細胞等，因此，Villin蛋白在胃腸道癌、胰腺癌和膽管癌中有較高的表達[16]。VEGFR-3是受體型酪氨酸蛋白激酶家族成員，是第一個被鑒定的淋巴管內皮標記物，它在腫瘤組織血管和淋巴管中均有表達，血管內皮生長因子-C(VEGF-C)可以與VEGFR-3結合參與淋巴管生成的調控，促進腫瘤轉移[17]。本研究中，Villin的表達率僅為15.9%，這可以作為鑒別間皮瘤和腺癌的特異抗體之一，而VEGFR-3的陽性率也僅為18.2%，這提示MPeM不是以淋巴轉移為主，而是以匍匐浸潤為主要轉移方式。

值得注意的是，本研究中，PD-L1的陽性率僅為6.8%。PD-L1可以負性調控T淋巴細胞介導的腫瘤殺傷反應，從而使腫瘤細胞逃離免疫系統的監視，避免免疫細胞的殺傷[18]。筆者推測，腹膜間皮瘤屬于惰性腫瘤，轉移或浸潤慢，PD-1及其配體PD-L1可能未啟動腫瘤殺傷效應，本組中有1例患者口服PD-1抑制劑pembrolizumab，復查腹膜間皮瘤較前進展，提示對于腹膜間皮瘤，不適宜應用PD-1抑制劑pembrolizumab治療，并且PD-L1也不適宜用于MPeM的檢測及預后。

綜上所述，在本組MPeM中，MCM2和FLI-1對于診斷MPeM具有較高的敏感性，VEGFR-3和Villin對于鑒別腺癌和MPeM具有一定價值，Ki67和TNM分期是影響預后的獨立危險因素。由于本組病例數較少，需進一步增加樣本量以增進準確性。