人子宮內膜異位癥的可示蹤裸鼠模型構建*

關綺蕙，史文靜，周龍書，李 露

(廣州醫科大學附屬第二醫院婦產科，廣州 510260)

子宮內膜異位癥(以下簡稱“內異癥”)是指子宮內膜組織出現在子宮體以外的部位，其治療方式主要有手術及藥物治療，其中藥物治療只能對癥治療而不能去除異位的內膜細胞，而手術治療有較高的復發率[1]。因此，如何提高內異癥的臨床治療效果是迫切需要解決的問題。目前國內外已建立的內異癥動物模型都存在一定的缺陷[2]，限制了基礎研究成果向臨床轉化的可能性。本文將內異癥患者的在位子宮內膜制成組織懸液，應用慢病毒載體將熒光素酶和紅色熒光蛋白基因轉入子宮內膜組織，并注射到裸鼠腹腔內，以構建可示蹤的內異癥裸鼠模型，為內異癥的發病機制和新治療藥物的篩選及藥理藥效學研究提供堅實的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料 子宮內膜組織均來自本院因卵巢巧克力囊腫合并子宮肌瘤行全子宮切除術的在位子宮內膜，所有患者術前3個月內均未接受激素類藥物治療，既往未合并其他內、外科疾病、免疫性及其他惡性疾病；36只無特殊病原體(SPF)級6～8周齡BALB/C雌性裸鼠購自中山大學動物實驗中心，體質量(16±4)g；LV-RFP-Luc購自上海漢恒生物有限公司，D-Luciferin購自美國Goldbio公司；小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體-7(V-7)、小鼠抗人細胞角蛋白單克隆抗體-18(CK-18)均購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗人單克隆抗體-CD34(CD34)購自廣州創科偉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1子宮內膜組織采集及體外病毒轉染 用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗新鮮收集的內膜組織并將其剪碎為糊狀懸液。將其分為等體積的A、B兩組，分別接種于無菌六孔板內，每孔加入含有20%胎牛血清和0.002 5 μg/mL 17β-雌二醇(E2)的DMEM/F12培養基2 mL，A組每孔加入含有終濃度5 μg/mL Polybrene滴度為1×108IU/mL的LV-RFP-Luc，并于體外轉染24 h；B組加入等體積的培養基。兩組均置入37 ℃ 5% CO2培養箱培養，24 h后將兩組子宮內膜組織培養液均換成含有20%胎牛血清和0.002 5 μg /mL E2的DMEM/F12培養基2 mL，培養48 h后在熒光顯微鏡下觀察子宮內膜組織塊的熒光表達情況。

1.2.2構建動物模型 將裸鼠等數量分為A、B、C 3組,每組12只。3組中每只裸鼠分別于腹腔內一次性注射等體積的已轉染的組織塊懸液、未轉染的組織塊懸液和DMEM/F12培養基。注射后參考文獻[3]肌內注射E2(0.02 μg/d)。種植后每隔7天1次在活體成像儀下監測異位病灶的發展情況。

1.2.3異位病灶的采集及形態和來源鑒定 于建模后第28天頸椎脫臼處死裸鼠，剖腹觀察異位病灶的生長情況并分離異位病灶。異位病灶分離后分別放入裝有4%多聚甲醛溶液的離心管中固定，并分別按試劑盒操作說明行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學鑒定。若HE染色病灶中有子宮內膜腺體組織、間質細胞及新生血管形成，且免疫組織化學鑒定子宮內膜腺體組織和間質細胞均來源于人類，則提示裸鼠內異癥模型建模成功[4]。

2 結 果

2.1體外LV-RFP-Luc轉染情況及鑒定 (1)A組子宮內膜組織體外培養至48 h在熒光顯微鏡下觀察示：子宮內膜組織塊紅色熒光蛋白表達明亮，細胞陽性數率多(圖1C)；其快速冰凍切片可見典型的腺體結構(圖1D)。(2)HE染色結果顯示：A組和B組的子宮內膜組織塊均保持著完整的子宮內膜腺體結構 (圖1A、B)。

A： A組組織；B：B組組織；C：A組組織塊；D：A組快速冰凍切片

圖1 子宮內膜組織轉染情況(HE，×200)

2.2活體成像儀監測異位病灶

2.2.1活體成像儀下異位病灶的熒光信號ROI表達 各組裸鼠在整個生長周期中，生長狀況良好，實驗中未發現裸鼠感染和(或)死亡等情況。A組11只裸鼠在活體成像下均能檢測到腹腔異位病灶發出的熒光信號；其中1只裸鼠于造模后第21、28天均未檢測到異位病灶的熒光信號。動態檢測到異位病灶發出熒光信號ROI值由第7天至第14天先變小，由第14天至第28天逐漸增大。而B組和C組均未檢測到異位病灶熒光信號(圖2)。

圖2 活體成像儀下異位病灶熒光信號ROI表達

2.2.2腹腔內異位病灶發出熒光信號ROI值 異位病灶發出熒光信號的ROI值先減小后增大：第7、14、21、28天分別為(7.008±1.024)×106、(4.363±0.731)×106、(5.113±0.696)×106、(6.34±0.713)×106，第7天至第14天，熒光信號ROI值先減小，差異有統計學意義(P<0.01)；第14天至第28天，ROI值增大，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 異位病灶ROI值趨勢的曲線圖

*：P<0.05；#：P<0.01；n=13

圖4 異位病灶ROI值的比較

2.2.3剖腹后裸鼠腹腔內異位病灶形成情況 (1)A組中腹腔內連續檢測到熒光信號的裸鼠剖腹后肉眼均可見透明紫色囊腫或白色硬結(圖5A白色單箭頭所指)，未見其他游離病灶。異位病灶周圍可見豐富血管形成或點狀出血，囊內積聚暗紅黏稠液體(圖5B白色雙箭頭所指)。大部分異位病灶黏附于腸系膜、膀胱旁脂肪墊等處，且與周圍組織存在輕度粘連。另外1只于第21、28天均未能檢測到熒光信號的裸鼠剖腹后未見任何異位病灶，提示該個體造模失敗。(2)B組中所有裸鼠腹腔內均可見透明紫色囊腫或白色硬結(圖5C白色單箭頭所指)，未見游離病灶。異位病灶周圍可見豐富血管形成，囊內積聚清亮液體。大部分異位病灶黏附于腸系膜、膀胱旁脂肪墊等處，且與周圍組織存在輕度粘連(圖5D白色雙箭頭所指)，C組未見明顯異位病灶。

2.2.4異位病灶HE染色及免疫組織化學鑒定結果 (1)A、B兩組裸鼠的每個異位病灶均可見典型的內膜腺體結構，血管增殖豐富，未侵入腺泡腔。其組織學形態特征和人原發內異癥的表現極為相似，無明顯病理學改變，且兩組的形態學結構未見明顯異常(圖6A、B)。(2)A組和B組裸鼠腹腔中種植成功的異位病灶，間質細胞質、腺上皮細胞質、血管內皮細胞質分別被V-7、CK-18、CD34染成棕黑色(見圖6C～H)。證明了移植的子宮內膜組織并未改變子宮內膜組織細胞的特異性蛋白表達，確定異位病灶組織與人類的子宮內膜組織同源，提示了可示蹤內異癥動物模型建模成功。

A、B：A組裸鼠；C、D：B組裸鼠

圖5 A組和B組異位病灶

A、B：裸鼠的異位病灶組織形態(HE)；C、D：CK-18表達水平(免疫組織化學)；E、F：V-7表達水平(免疫組織化學)；G、H：CD34表達水平(免疫組織化學)

圖6 A、B兩組異位病灶HE染色及免疫組織化學鑒定(×200)

2.2.5各組異位病灶成模率 A組異位病灶成模率為91.67%，B組異位病灶成模率為100.00%，C組未見任何異位病灶。

3 討 論

內異癥可引起痛經、性交痛、不孕等癥狀[5]，迄今為止其發病機制仍不明確。由于倫理學方面的約束，動物模型已成為研究發病機制和治療方法的主要途徑。動物模型可分為靈長類和嚙齒類動物，其中靈長類動物具有成模率低、費用昂貴等問題，限制其在研究中的應用。而嚙齒類動物具有費用低廉、易于繁殖等優點，因此可用于內異癥的發病機制及治療等方面的研究[6]。

目前應用的嚙齒類內異癥動物模型有大鼠自體移植模型和免疫缺陷小鼠異體移植模型。大鼠自體移植模型雖然存在很多優點如易于生長、移植物無自身免疫抵抗等[7-8]，但移植物本身來源于實驗動物，與人類的種屬差異性較大，實驗結果不能直接應用于人類。在免疫缺陷小鼠異體移植模型中，人子宮內膜被直接種植于小鼠腹腔內，移植的內膜組織保留原來的組織形態和生化特性，可以在動物體內研究人子宮內膜的侵襲演變過程。GREAVES等[9]和 YAMAGATA等[10]將人子宮內膜組織碎片或子宮內膜細胞懸液，注射到裸鼠的腹腔中成功構建內異癥病灶。AGOSTINIS等[11]通過把卵巢巧克力囊腫患者的囊內組織和在位內膜的組織碎片，注射到SCID小鼠的腹腔內，成功構建內異癥病灶。HE等[12]將人子宮內膜細胞注射到裸鼠身上，成功構建內異癥病灶，成模率高達80%。

以往在內異癥病灶發展的研究中，常根據在特定時間進行開腹探查后所得的異位病灶體積、大小等來評價病灶發展情況[13-14]。該方法缺乏對同一病灶準確、實時的監控，不能明確區分病灶與周圍組織，需在不同的時間點犧牲實驗動物[15]。近年來，活體無創觀察方法備受關注。其原理是應用病毒載體將熒光素酶或熒光蛋白基因轉入子宮內膜細胞或組織，把已轉染的細胞或組織種植于實驗動物身上，運用活體成像儀即可監測異位病灶的位置及其大小[16]。FERRERO等[17]成功建立了內異癥小鼠模型，通過無創監測來研究內異癥病灶早期的生長和進展情況。WANG等[18]將含有紅色熒光蛋白基因的腺病毒轉染內膜細胞，然后將其注射于裸鼠皮下或腹腔內，通過熒光掃描成像系統監測病灶的生長情況。本實驗方法靈敏度高、特異性強，能實時監測活體動物病灶的動態變化，避免了處死動物帶來的實驗損耗，以及只能單次對同一個體進行病灶生長情況評估等缺點，具有不可比擬的優越性[19]。

本實驗中HE染色及免疫組織化學結果證明了移植的內膜組織并未改變其特異性蛋白表達，確定異位病灶組織與人子宮內膜組織同源，與ZHAO等[20]報道相符。而通過活體成像系統監測到的異位病灶熒光信號ROI值先減小后增大，與SOHNGEN等[21]和GROOTHUIS等[22]報道相符。可示蹤的內異癥裸鼠模型造模成功。

與以往的大鼠自體移植法建模及有創測量法相比，本方法采取人的子宮內膜組織建立模型，減少了因物種差異帶來的結果偏差；使用無創的監測手段，減少實驗動物損耗，可連續、實時、準確地觀察病灶的生長情況。本研究通過建立可靠、重復性強、可示蹤的內異癥動物模型，為研究內異癥提供堅實的研究平臺，可廣泛應用于臨床前內異癥新藥療效測試及內異癥的發生機制研究。